劉晨濤 薄建萍 加 慧 董艷婷 田新瑞

支氣管哮喘(bronchial asthma，簡(jiǎn)稱哮喘)，是由多種細(xì)胞及細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，以氣道的高反應(yīng)性(airway hyperreactivity, AHR)和氣道炎癥為重要特征。在氣道炎癥發(fā)生機(jī)制中，上皮細(xì)胞損傷、間質(zhì)增生發(fā)揮主要作用。本研究通過復(fù)制哮喘大鼠氣道炎癥模型，給予地塞米松、接種卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin, BCG)及BCG治療干預(yù)，觀察肺泡灌洗液(bronehoalveolar lavage fluid, BALF)細(xì)胞及嗜酸性粒細(xì)胞總數(shù)、上皮間質(zhì)標(biāo)志物變化，探討氣道上皮細(xì)胞的損傷和間質(zhì)改變?cè)谙瓪獾姥装Y發(fā)病機(jī)制中的作用及BCG對(duì)支氣管哮喘氣道炎癥的預(yù)防治療作用及機(jī)制。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

選擇SPF級(jí)Wistar雄性大鼠40只，2～3個(gè)月齡，體質(zhì)量160～180 g(由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，隨機(jī)分為5組，每組8只動(dòng)物。卵白蛋白(ovalbumin, OVA)(由美國sigma公司生產(chǎn))；氫氧化鋁(aluminumhydroxide, Al(OH)3)(由天津化學(xué)試劑三廠生產(chǎn))，彩云JWC-201D型霧化器(由鞍山市同信醫(yī)用儀器廠生產(chǎn))；地塞米松磷酸鈉注射液5 mg/1 ml/支(山東新華制藥股份有限公司)；BCG 0.5 mg/支(成都生物制品研究所有限責(zé)任公司)；TGF-β1 ELISA試劑盒(武漢博士德生物公司)；E-cadherin 、Fibronectin、α-SMA小鼠抗大鼠一抗(SantaCruz公司)，F(xiàn)ITC標(biāo)志的羊抗小鼠IgG(武漢博士德生物工程有限公司)，SABC抗鼠試劑盒及DAB顯色劑(武漢博士德生物公司)。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 實(shí)驗(yàn)分組： 取40只SPF級(jí)Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、哮喘組、BCG治療組、地塞米松治療組、BCG接種組；哮喘組、BCG治療組、地塞米松治療組均于實(shí)驗(yàn)第1、8天對(duì)大鼠腹腔注射OVA 100 mg和氫氧化鋁100 mg混懸液1 ml進(jìn)行致敏，第15天開始每日激發(fā)前30 min分別給予腹腔注射蒸餾水0.16 ml、皮內(nèi)注射BCG 0.025 mg、腹腔注射地塞米松0.25 mg/kg，并將大鼠置于自制的密閉霧化吸入箱內(nèi)，予1% OVA蒸餾水30 ml霧化吸入30 min，1次/d，共2周。BCG接種組在OVA致敏前7、3、1 d，每只大鼠分別皮內(nèi)注射BCG 0.025 mg，余處理同哮喘組，對(duì)照組均給予蒸餾水替代處理。

2. 標(biāo)本制備： 每只大鼠在末次霧化后的24 h內(nèi)用25%烏拉坦0.4 ml/100 g腹腔注射麻醉，打開胸腔，暴露心臟，心臟穿刺取血約5 ml，4 ℃，以離心半徑8 cm，2000 r/min離心10 min，留取血清，置-80 ℃冰箱中保存待測(cè)；暴露氣管，放留置針，用NS行左全肺灌洗，每次1 ml，充分回收，反復(fù)3次，共回收約2 ml，20 ℃，以離心半徑8 cm，2000 r/min離心10 min，留取上清，置-80 ℃冰箱中保存，行ELISA檢測(cè)，留取沉淀行細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)。取大鼠右肺，置0.1 mol/L的多聚甲醛中固定，用于組織病理學(xué)分析。HE染色觀察支氣管、小血管管壁、肺泡及肺間隔內(nèi)細(xì)胞浸潤情況、水腫和上皮損傷程度，支氣管平滑肌改變情況等，免疫組織化學(xué)染色(SABC法)檢測(cè)大鼠肺組織E-cadherin、α-SMA、Fibronectin的表達(dá)。

3. 圖像分析： HE染色切片上100倍光鏡下選擇完整支氣管橫斷面測(cè)量支氣管基底膜周徑(Pbm)。支氣管總面積(At)、管腔面積(Ac)、平滑肌外緣內(nèi)氣管面積(AMe)，平滑肌內(nèi)緣內(nèi)氣管面積(AMi)。計(jì)算公式：支氣管壁厚度=(At-Ac)/Pbra，平滑肌厚度=(AMe-AMi)/Pbm；衡量氣道改變情況[1]。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、癥狀觀察

哮喘組大鼠致敏激發(fā)后出現(xiàn)煩躁不安、抓耳撓腮、易驚、尖叫、然后伏俯不動(dòng)、口唇紫紺、呼吸急促、大小便失禁、部分腹部肌痙攣等過敏反應(yīng)[2-3]；治療組、接種組和對(duì)照組相對(duì)安靜，過敏反應(yīng)隨治療時(shí)間的延長癥狀漸減輕。

二、肺組織病理學(xué)檢查

對(duì)照組肺組織及支氣管均無炎癥改變，見圖1。哮喘組外觀上見肺體積增大，表面腫脹，有不規(guī)則暗紅色充血區(qū)；支氣管及肺泡內(nèi)黏液分泌增多，大量炎性細(xì)胞浸潤：淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等；支氣管管壁變厚、氣道變窄，氣道上皮受損腫脹，部分可見脫落，見圖2。BCG組、地米組、BCG接種組與哮喘組相比上述改變明顯減輕，但變化仍明顯于對(duì)照組，見圖3。各組大鼠支氣管肺泡灌洗液細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)，見表1。各組大鼠支氣管管壁厚度，見表2。各組大鼠肺泡灌洗液、血清中TGF-β含量比較，見表3。各組大鼠肺組織中E-cadherin、β-catenin、α-SMA、Fibronectin表達(dá)的比較，見表4。

表1 各組大鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)中細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(EOS)

(對(duì)照組)

表2 各組大鼠支氣管壁及平滑肌的厚度

注：與對(duì)照組相比：aP<0.01；與哮喘組相比：bP<0.01；與BCG組比較：cP<0.01

(哮喘組)

表3 各組大鼠肺泡灌洗液、血清TGF-β含量

注：與對(duì)照組相比：aP<0.01；與哮喘組相比：bP<0.01；與BCG組相比：cP<0.01；與地米組相比：dP<0.01

討 論

支氣管哮喘是一種以嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞等多種炎性細(xì)胞參與的以氣道變應(yīng)性炎癥、AHR及可逆性氣道阻塞為特征的疾病。氣道的慢性炎癥被認(rèn)為是哮喘的本質(zhì)[4-5]，從哮喘的主要誘發(fā)因素以及對(duì)哮喘患者病理研究發(fā)現(xiàn)，免疫反應(yīng)是哮喘患者產(chǎn)生氣道慢性炎癥的主要原因[6]。嗜酸性粒細(xì)胞是支氣管哮喘發(fā)病機(jī)制中的主要效應(yīng)細(xì)胞[7]，與哮喘氣道炎癥、氣道重塑、肺中痰聚集及氣道高反應(yīng)性及哮喘病情的嚴(yán)重程度有關(guān)[8-11]。支氣管哮喘早期病理改變主要是支氣管黏膜的腫脹、充血、分泌物增多、氣道內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤、氣道平滑肌痙攣等一些可逆性的病理改變。

哮喘的經(jīng)典發(fā)病機(jī)制是輔助性T淋巴細(xì)胞Th1/Th2 亞群比例失衡和功能紊亂，正常情況下，兩者處于相對(duì)平衡狀態(tài)，維持機(jī)體正常的細(xì)胞和體液免疫功能[12-13]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是維持人體外周免疫耐受的重要因子[14-15]，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞根據(jù)來源不同，主要分為天然型和誘導(dǎo)型Tr細(xì)胞。誘導(dǎo)性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(iTregs)是多種環(huán)境因素在幼稚T細(xì)胞中誘導(dǎo)產(chǎn)生的具有調(diào)節(jié)活性的T細(xì)胞，主要包括Trl 和Th3細(xì)胞兩種類型[16]。Tr1主要通過分泌IL-10來抑制T細(xì)胞的增殖，具有旁觀者抑制效應(yīng)和免疫記憶力；Th3主要分泌TGF-β來實(shí)現(xiàn)對(duì)Th1和Th2的抑制作用[17]。

本研究中觀察到哮喘大鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)、EOS計(jì)數(shù)及BALF及血清中TGF-β1含量增加，氣道壁及氣道平滑肌明顯增厚，氣道變窄，氣道上皮受損腫脹，部分可見脫落，間質(zhì)細(xì)胞增多，基底膜增厚，支氣管及肺泡內(nèi)黏液分泌增多，大量炎性細(xì)胞浸潤，多為淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等。SABC法測(cè)得間質(zhì)標(biāo)志物Fibronectin、α-SMA表達(dá)增加，平滑肌細(xì)胞增生，上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)降低，表明哮喘性慢性炎癥致TGF-β1含量增加、上皮細(xì)胞損傷間質(zhì)細(xì)胞增多是哮喘氣道炎癥形成的重要機(jī)制之一。

(BCG組) (地米組) (BCG接種組)

表4 各組大鼠肺組織中E-cadherin、α-SMA、Fibronectin平均光密度值

注：與對(duì)照組相比：aP<0.01，bP<0.05；與哮喘組相比：cP<0.05；與BCG組相比：dP<0.01；與地米組相比：eP<0.01

BCG是經(jīng)熱酚法提取的多糖酸類物質(zhì)，并具有活化巨噬細(xì)胞、增強(qiáng)T細(xì)胞、B細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫和體液免疫功能，目前已廣泛應(yīng)用于臨床治療哮喘等自身免疫性疾病[18]。研究證實(shí)BCG可以減少OVA激發(fā)的氣道炎癥及重塑，其中氣道周圍α-SMA水平、氣道纖維化及氣道上皮黏液堆積也減少，BCG還可減少TGF-β1的表達(dá)[19]，這可能與其能誘導(dǎo)機(jī)體的Th1免疫功能有關(guān)。地塞米松是經(jīng)典的抗炎、治療哮喘的藥物，眾多實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，地塞米松能干預(yù)氣道炎癥中嗜酸性粒細(xì)胞及氣道重塑中平滑肌的增殖過程，延緩氣道炎癥及重塑的進(jìn)程。本研究顯示地塞米松治療組大鼠，氣道炎癥及氣道阻塞不明顯，BALF中細(xì)胞總數(shù)及EOS計(jì)數(shù)明顯減少，BALF及血清TGF-β1含量較哮喘組明顯下降，上皮細(xì)胞損傷間質(zhì)轉(zhuǎn)化顯著減輕，SABC法測(cè)得E-cadherin表達(dá)明顯升高，F(xiàn)ibronectin、α-SMA的表達(dá)明顯下降，與哮喘組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與地塞米松治療哮喘相比，BCG具有調(diào)節(jié)免疫、副作用小、應(yīng)用方便的優(yōu)勢(shì)，但其對(duì)支氣管哮喘氣道炎癥及氣道阻塞的預(yù)防及治療作用的機(jī)制，目前研究及報(bào)道甚少。本研究中BCG接種組及BCG治療組與哮喘組相比，大鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)及EOS計(jì)數(shù)明顯減少，氣道炎癥明顯減輕，BALF及血清中的TGF-β1含量下降，氣道壁及平滑肌無明顯增厚，氣道阻塞程度、上皮細(xì)胞損傷間質(zhì)轉(zhuǎn)化明顯減輕，α-SMA、Fibronectin表達(dá)下降，E-cadherin表達(dá)增加，其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明接種BCG和BCG治療對(duì)哮喘大鼠氣道炎癥及氣道阻塞具有預(yù)防和治療作用。其機(jī)制可能是通過免疫調(diào)節(jié)抑制TGF-β1表達(dá)，阻斷了TGF-β1所致的上皮細(xì)胞損傷間質(zhì)轉(zhuǎn)化。提示預(yù)防接種BCG可以達(dá)到與地塞米松治療相同的減輕氣道炎癥的作用。緩解期哮喘采用BCG及類似物進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)，有可能減少或控制哮喘發(fā)作。

綜上所述，支氣管哮喘發(fā)生時(shí)，TGF-β1含量增加介導(dǎo)的上皮細(xì)胞損傷間質(zhì)轉(zhuǎn)化是其重要機(jī)制之一。接種BCG及采用BCG治療可減輕哮喘大鼠氣道炎癥及氣道阻塞程度，這可能是通過BCG對(duì)Th1的免疫調(diào)節(jié)作用，使得TGF-β1含量下降，上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化減少實(shí)現(xiàn)的。本研究結(jié)果為臨床應(yīng)用BCG治療哮喘提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

參 考 文 獻(xiàn)

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