段麗娜 路紅濤

急性肺損傷 (acute lung injury, ALI) 是各種原因?qū)е碌姆闻萆掀ぜ?xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，導(dǎo)致的急性低氧性呼吸功能不全[1]。其病理生理機(jī)制包括氧化反應(yīng)與抗氧化反應(yīng)的失調(diào)和炎癥反應(yīng)與抗炎反應(yīng)的失調(diào)[2]。盡管目前有多項(xiàng)治療方法，但是尚無有效的干預(yù)措施，病死率極高[3-4]。因此急需尋找有效的藥物治療急性肺損傷。

Resolvins為內(nèi)源性抗炎物質(zhì)Omega-3多不飽和脂肪酸(EPA和DHA)的代謝產(chǎn)物。EPA和DHA可分別產(chǎn)生E-系列(Resolvin E)和D-系列(Resolvin D)的Resolvins。 多個(gè)研究顯示Resolvin D1(RvD1)具有可緩解小鼠模型變應(yīng)性氣道炎癥等多種抗炎作用[5-7]，然而尚未見到RvD1對急性肺損傷保護(hù)作用的相關(guān)研究。因此我們假設(shè)RvD1對脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷具有保護(hù)作用，并進(jìn)一步探討可能的機(jī)制。

材料和方法

一、主要試劑

雄性BALB/c小鼠21只，體質(zhì)量20～25 g由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供。 RvD1購于Cayman公司。丙二醛(malondialdehyde, MDA)測試盒購于南京建成生物工程研究所。LPS購于Sigma公司。IL-10、IL-6 ELISA檢測試劑盒是由武漢博士德生物工程有限公司提供。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃头纸M： BALB/c小鼠隨機(jī)分3組(7只/組)。利用10%水合氯醛麻醉小鼠(0.3～0.4 ml/kg)。①對照組，氣道內(nèi)滴注PBS 60 μl；②LPS模型組：氣管插管，氣道內(nèi)滴注LPS(100 μg/60 μl); ③RvD1組：在氣道內(nèi)滴注LPS 30 min前，尾靜脈注射RvD1(600 ng(100 μl)/小鼠)。LPS氣道滴注6 h后處死小鼠。小鼠均在西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心SPF級動物房飼養(yǎng)。

2. 收集支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF): 造模6 h后將小鼠麻醉，股動脈放血處死，利用0.6 ml預(yù)冷的PBS進(jìn)行支氣管肺泡灌洗(2次/只)，肺泡灌洗液的回收率達(dá)80%。BALF在4 ℃，800×g，離心10 min。分別收集沉淀和上清，BALF上清液在-80 ℃保存?zhèn)溆谩ｋx心后的細(xì)胞沉淀用PBS重新重懸，利用細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。取細(xì)胞沉淀涂片，涼干后行瑞氏染色，進(jìn)行中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)。

3. 肺組織病理學(xué)檢查: 取出左肺組織放入10%甲醛固定，固定后進(jìn)行脫水，透明，石蠟包埋后切片(4 μm)，進(jìn)行蘇木素-伊紅( HE )染色，光鏡觀察肺組織病理學(xué)改變。

4. 肺組織內(nèi)MDA含量測定： 肺組織內(nèi)MDA濃度測定采用南京建成生物工程公司試劑盒，嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行操作。

5. BALF中IL-10、IL-6濃度檢測： BALF上清中IL-10、IL-6的濃度利用ELISA方法檢測，所有操作均嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)以M±SD形式表示。采用SPSS13.0軟件進(jìn)行正態(tài)性檢測，方差齊性檢驗(yàn)。組間比較采用單因素方差分析，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)轉(zhuǎn)換后再進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、RvD1對肺組織病理改變的影響

如圖1所示，與對照組相比，氣道內(nèi)滴注LPS的小鼠肺組織病理顯示，肺泡及肺間質(zhì)大量出血，組織水腫，肺泡間隔增厚，正常的肺組織結(jié)構(gòu)明顯被破壞。而應(yīng)用RvD1預(yù)處理(在LPS給藥前30 min)小鼠后上述改變被明顯減輕。

對照組

LPS模型組

Resolvin

二、RvD1對小鼠肺組織浸潤炎癥細(xì)胞數(shù)的影響

如圖2所示氣道內(nèi)滴注LPS 6 h后，(圖2A) BALF內(nèi)炎癥細(xì)胞數(shù)顯著升高 (P<0.01，與對照組相比)，(圖2B)中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著升高(P<0.01，與對照組相比)。而應(yīng)用RvD1預(yù)處理后，可顯著減輕LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷炎癥細(xì)胞的浸潤。

注：A: BALF中炎癥細(xì)胞總數(shù)計(jì)數(shù)；B: BALF內(nèi)中性粒細(xì)胞數(shù)；*P<0.01 vs. 對照組; #P<0.01 vs. LPS模型組

三、RvD1對小鼠肺組織MDA濃度的影響

如圖3所示，MDA為體內(nèi)脂質(zhì)氧化損傷的標(biāo)志。與對照組比較， LPS模型組MDA的濃度明顯升高(P<0.01)。而而應(yīng)用RvD1預(yù)處理后，可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的MDA濃度升高。

注：*P<0.01 vs. 對照組; #P<0.01 vs. LPS模型組

四、RvD1對小鼠肺組織分泌細(xì)胞因子的影響

如圖4所示，氣道內(nèi)滴注LPS 6 h后， BALF中IL-6(圖4A)的濃度與對照組相比顯著升高(與對照組相比P<0.01)，保護(hù)性細(xì)胞因子IL-10 (圖4B) 較對照組有所升高，而應(yīng)用RvD1在LPS干預(yù)前30 min預(yù)處理小鼠，BALF中IL-6濃度顯著下降，保護(hù)性細(xì)胞因子IL-10顯著升高(與LPS模型組相比P<0.01)。提示RvD1可能抑制急性肺損傷小鼠促炎性細(xì)胞因子的分泌，促進(jìn)抗炎性細(xì)胞因子的分泌，改善促炎反應(yīng)與抗炎反應(yīng)的平衡，從而對急性肺損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

注：A: IL-6在BALF中的濃度；B: IL-10在BALF中的濃度；*P<0.01 vs. 對照組; #P<0.01 vs. LPS模型組

討 論

在LPS誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷模型中，RvD1預(yù)處理可顯著減輕肺組織病理損傷，減少肺組織內(nèi)浸潤的炎癥細(xì)胞，抑制炎性細(xì)胞因子IL-6的分泌，促進(jìn)保護(hù)性細(xì)胞因子IL-10的分泌，通過減少M(fèi)DA的產(chǎn)生，進(jìn)而減輕氧化損傷，從多方面對急性肺損傷起保護(hù)作用。

當(dāng)機(jī)體遭遇各種炎性刺激(如感染等)后，可促進(jìn)炎癥細(xì)胞在肺組織內(nèi)大量浸潤，促進(jìn)各種氧自由基產(chǎn)生，促進(jìn)TNF-α，IL-6，IL-1等促炎性細(xì)胞因子的大量釋放，促進(jìn)組織水腫，進(jìn)而加劇組織損傷[8-9]。本研究中得出了相同的結(jié)論，在LPS干預(yù)組小鼠肺組織內(nèi)浸潤炎癥細(xì)胞總數(shù)及中性粒細(xì)胞數(shù)顯著增多，脂質(zhì)氧化損傷指標(biāo)MDA含量顯著升高，上述改變提示LPS誘導(dǎo)小鼠急性肺損傷模型制作是成功的。

促炎細(xì)胞因子在急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征中起關(guān)鍵性作用。研究顯示急性肺損傷和敗血癥臨床患者，如IL-6和TNF-α等促炎性細(xì)胞因子持續(xù)性升高，則表示患者預(yù)后極差[10]。因此IL-6作為炎癥的標(biāo)志，其水平高低可顯示炎癥的輕重，本研究中IL-6明顯升高，也提示急性肺損傷模型制作的成功。

在對急性肺損傷藥物干預(yù)研究中顯示，藥物處理可顯著抑制TNF-α，IL-6，IL-1等炎性細(xì)胞因子的分泌，減輕組織氧化損傷，進(jìn)而減輕動物模型肺損傷，對肺組織起到保護(hù)作用[8-9, 11]。本研究中顯示了相同的結(jié)論，而RvD1預(yù)處理后可顯著減少肺組織內(nèi)浸潤的炎癥細(xì)胞，抑制IL-6的大量分泌，減輕脂質(zhì)氧化損傷，減輕小鼠肺組織病理損傷，對小鼠急性肺損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

急性肺損傷的病理機(jī)制為抗炎反應(yīng)與驗(yàn)證反應(yīng)的失衡，而體內(nèi)失控性釋放的大量炎癥介質(zhì)與抗炎因子間的平衡決定了急性肺損傷病情的發(fā)展。IL-10作為人體內(nèi)重要的抗炎因子，可抑制炎性反應(yīng)，重建抗炎反應(yīng)和炎癥反應(yīng)的平衡。研究發(fā)現(xiàn)，因ARDS死亡患者的疾病初期，如BALF中的IL-10濃度過低，則預(yù)后較差，提示IL-10不足可能是體內(nèi)失控性炎癥反應(yīng)與抗炎反應(yīng)失衡導(dǎo)致ARDS的預(yù)后較差[12-13]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)動物吸入IL-10可顯著抑制BALF中TNF-α、IL-1β及IL-6的分泌，從而對急性肺損傷發(fā)揮保護(hù)作用[14-15]。因此IL-6/IL-10的比例在一定程度上反應(yīng)了疾病的走向。在本研究中LPS模型組小鼠IL-6較對照組升高5.7倍，IL-10僅僅升高1.8倍，促炎反應(yīng)與抗炎反應(yīng)失衡。而應(yīng)用RvD1預(yù)處理后IL-10的分泌較LPS模型組比較升高了16倍，RvD1可能具有重建炎癥反應(yīng)與抗炎反應(yīng)的平衡，改善急性肺損傷的作用。

本研究證明了RvD1可促進(jìn)抗炎性細(xì)胞因子IL-10的分泌，抑制促炎性細(xì)胞因子IL-6的產(chǎn)生，減少炎癥細(xì)胞的浸潤，改善肺組織病理變化，減輕組織氧化損傷，重建炎癥反應(yīng)與抗炎反應(yīng)的再平衡，從多個(gè)方面抑制急性肺損傷的發(fā)生、發(fā)展。上述研究結(jié)果提示RvD1可能具有治療急性肺損傷的潛在作用。

參 考 文 獻(xiàn)

1 Johnson ER, Matthay MA. Acute Lung Injury: Epidemiology, Pathogenesis, and Treatment[J]. J Aerosol Med Pulm Drug Deliv, 2010, 23(4): 243-252.

2 Cross L, Matthay M. Biomarkers in Acute Lung Injury: Insights into the Pathogenesis of Acute Lung Injury[J]. Crit Care Clin, 2011, 27(2): 355-377.

3 Frank A, Thompson B. Pharmacological Treatments for Acute Respiratory Distress Syndrome[J]. Curr Opin Crit Care, 2010, 16(1): 62-68.

4 金發(fā)光. 急性肺損傷的診治研究現(xiàn)狀及進(jìn)展[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2013， 6(1)： 1-3.

5 Arita M, Ohira T, Sun Y P, et al. Resolvin E1 Selectively Interacts with Leukotriene B4 Receptor Blt1 and Chemr23 to Regulate Inflammation[J]. J Immunol, 2007, 178(6): 3912-3917.

6 Rogerio AP, Haworth O, Croze R, et al. Resolvin D1 and Aspirin-Triggered Resolvin D1 Promote Resolution of Allergic Airways Responses[J]. J Immunol, 2012, 189(4): 1983-1991.

7 Schwab JM, Chiang N, Arita M, et al. Resolvin E1 and Protectin D1 Activate Inflammation-Resolution Programmes[J]. Nature, 2007, 447(7146): 869-874.

8 Yan YJ, Li Y, Lou B, et al. Beneficial Effects of Apoa-I on Lps-Induced Acute Lung Injury and Endotoxemia in Mice[J]. Life Sci, 2006, 79(2): 210-215.

9 Pascutti MF, Pitashny M, Nocito AL, et al. Benznidazole, a Drug Used in Chagas′Disease, Ameliorates Lps-Induced Inflammatory Response in Mice[J]. Life Sci, 2004, 76(6): 685-697.

10 Minamino T, Komuro I. Regeneration of the Endothelium as a Novel Therapeutic Strategy for Acute Lung Injury[J]. J Clin Invest, 2006, 116(9): 2316-2319.

11 Crisafulli C, Mazzon E, Paterniti I, et al. Effects of Liver X Receptor Agonist Treatment on Signal Transduction Pathways in Acute Lung Inflammation[J]. Respir Res, 2010, 11: 19.

12 Fumeaux T, Pugin J. Role of Interleukin-10 in the Intracellular Sequestration of Human Leukocyte Antigen-Dr in Monocytes During Septic Shock[J]. Am J Respir Crit Care Med, 2002, 166(11): 1475-1482.

13 Donnelly SC, Strieter RM, Reid PT, et al. The Association between Mortality Rates and Decreased Concentrations of Interleukin-10 and Interleukin-1 Receptor Antagonist in the Lung Fluids of Patients with the Adult Respiratory Distress Syndrome[J]. Ann Intern Med, 1996, 125(3): 191-196.

14 Hofstetter C, Flondor M, Hoegl S, et al. Interleukin-10 Aerosol Reduces Proinflammatory Mediators in Bronchoalveolar Fluid of Endotoxemic Rat[J]. Crit Care Med, 2005, 33(10): 2317-2322.

15 Kobbe P, Lichte P, Schreiber H, et al. Inhalative Ⅱ-10 Attenuates Pulmonary Inflammation Following Hemorrhagic Shock without Major Alterations of the Systemic Inflammatory Response[J]. Mediators Inflamm, 2012, 2012: 512974.