呂學(xué)軍 陸衛(wèi)忠 張永娟 郭 亮 李少瑩 李玉英 錢桂生

急性肺損傷(acute lung injury, ALI)與急性呼吸窘迫綜合癥(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是當(dāng)前危重疾病領(lǐng)域最為重視的研究熱點(diǎn)之一。長期以來，國內(nèi)外學(xué)者對該病進(jìn)行了大量研究，但迄今為止ALI/ARDS的發(fā)病機(jī)制仍不清楚[1]。肺泡上皮細(xì)胞為典型的極性細(xì)胞，細(xì)胞極性的變化與細(xì)胞功能密切相關(guān)，如分泌功能、液體清除功能、膜通道等。研究證實(shí)，ALI/ARDS時，肺泡上皮細(xì)胞存在極性損傷，而這種極性損傷在ALI/ARDS早期扮演重要角色。

新近研究發(fā)現(xiàn)，Clathrin蛋白是維持上皮細(xì)胞極性所必須的重要蛋白。Clathrin基因的沉默會干擾細(xì)胞膜基底外側(cè)蛋白的運(yùn)輸和再循環(huán)從而使其失去極性，但是對頂端蛋白的極性沒有影響[2]。因此，Clathrin對于上皮細(xì)胞的極性維持和調(diào)節(jié)起到關(guān)鍵作用，但Clathrin在ALI/ARDS發(fā)生時具體作用機(jī)制仍不明確。如能分離Clathrin相互作用蛋白，對于闡明Clathrin在ALI/ARDS肺泡上皮極性損傷中的具體作用機(jī)制具有重要價值。

因此，本研究應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)從小鼠肺cDNA文庫中篩選與Clathrin相互作用蛋白，進(jìn)一步闡明Clathrin在ALI/ARDS發(fā)生時肺泡上皮極性損傷中的具體作用機(jī)制。

材料與方法

一、pSos-Clathrin誘餌載體構(gòu)建

按小鼠Clathrin基因序列設(shè)計相應(yīng)引物，以含有Clathrin編碼序列的質(zhì)?？寺槟０?，分別在上游和下游引物引入BamH1及SalⅠ酶切位點(diǎn) (上游引物為：5′-ACGGGATCCATATGGCTGAGGACTTCGGCTTC-3′， 下游引物為： 5′-ACGCGTCGACCTAGCGGGACAGTGGTGTTTG-3′)，PCR擴(kuò)增Clathrin基因全長，產(chǎn)物長度：710 bp。PCR產(chǎn)物純化后經(jīng)BamH1和SalⅠ酶切，回收后與經(jīng)相同條件酶切回收的pSos載體連接，構(gòu)建重組載體pSos-Clathrin，酶切鑒定后測序。

二、Clathrin誘餌蛋白自激活實(shí)驗(yàn)

將下列質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化到制備好的感受態(tài)細(xì)胞中。

陽性對照組(Positive control)：pSos MAFB + pMyr SB

陰性對照組(Negative control)：pSos MAFB + pMyr Lamin C

實(shí)驗(yàn)組(Experiment group)：pSos Clathrin + pMyr SB； pSos Clathrin + pMyr Lamin C

7 d后平板上長出克隆，將克隆分別接種至兩塊SD/glucose (-UL)平板和兩塊SD/galactose (-UL)平板上。觀察克隆生長情況，確定誘餌蛋白自激活特性。

三、Clathrin 誘餌蛋白表達(dá)檢測

分別接種轉(zhuǎn)化pSos/Clathrin及pSos空載體的cdc25H酵母細(xì)胞至SD/-Leu培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，離心收集酵母細(xì)胞，完全裂解酵母細(xì)胞，提取蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF膜，封閉液封閉2 h，加入兔抗Sos蛋白多克隆抗體(1︰200)，結(jié)合4 h，羊抗兔IgG(1︰1000)二抗結(jié)合1 h后曝光，顯影定影。

四、Clathrin小鼠肺cDNA文庫篩選及陽性克隆驗(yàn)證

將pSos-Clathrin質(zhì)粒和pMyr-小鼠肺cDNA文庫質(zhì)粒共轉(zhuǎn)至感受態(tài)的酵母細(xì)胞中并將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物接種到SD/galactose (-UL)瓊脂平板。25 ℃孵育48 h，隨后轉(zhuǎn)入37 ℃孵育。7 d后，挑取62個克隆并重鋪在SD/glucose (-UL)瓊脂平板上，25 ℃孵育5 d。再將其分別重鋪在SD/glucose (-UL) 平板和SD/galactose(-UL) 平板上，找出37 ℃下在SD/galactose (-UL)平板上生長，而在SD/glucose (-UL)平板上不生長的克隆。分別擴(kuò)增含有陽性克隆的酵母細(xì)胞后提取文庫質(zhì)粒DNA并酶切鑒定。進(jìn)一步對篩選得到的陽性克隆進(jìn)行回轉(zhuǎn)驗(yàn)證。對回轉(zhuǎn)驗(yàn)證結(jié)果為陽性的文庫克隆質(zhì)粒送檢測序，分析克隆序列。

結(jié) 果

一、pSos-Clathrin誘餌載體構(gòu)建

重組載體pSos-Clathrin經(jīng)酶切并測序鑒定。結(jié)果表明插入的Clathrin基因序列及插入方向完全正確。酶切鑒定結(jié)果如圖1。

圖1 pSos-Clathrin重組載體酶切鑒定結(jié)果

二、Clathrin誘餌蛋白自激活實(shí)驗(yàn)

轉(zhuǎn)化鋪板6 d后所有平板上均長出克隆，取少許克隆培養(yǎng)物分別接種至兩塊SD/glucose (-UL)平板和兩塊SD/galactose (-UL)平板上。7 d后觀察各平板上克隆生長情況，如圖2、圖3。

圖2 各轉(zhuǎn)化組在25 ℃ SD/Glucose(-UL)和SD/Galactose(-UL)平板生長情況

圖3 各轉(zhuǎn)化組在37 ℃ SD/Glucose(-UL)和SD/Galactose(-UL)平板生長情況

結(jié)果顯示，對照組在各溫度及缺陷平板上關(guān)系正確。實(shí)驗(yàn)組在25 ℃ SD/Glucose(-UL)和SD/Galactose(-UL)平板上均有生長；在37 ℃SD/Glucose(-UL)平板上， 兩組均無生長； 在37 ℃ SD/Galactose(-UL)平板上，pSos Clathrin + pMyr SB生長，而pSos Clathrin+pMyr Lamin C不生長，表明Clathrin無自激活作用，適用于CytoTrap膜蛋白文庫篩選系統(tǒng)。

三、Clathrin 誘餌蛋白表達(dá)檢測

實(shí)驗(yàn)組在相對分子量145×103水平位置可檢測到Sos-Clathrin融合蛋白的表達(dá)?？蛰d體對照組可在相對分子量120×103左右處檢測到Sos蛋白的表達(dá)，如圖4。

注：Lane 1：轉(zhuǎn)化pSos/Clathrin組；Lane 2：pSos空載體對照組

四、Clathrin蛋白小鼠肺cDNA文庫篩選及陽性克隆驗(yàn)證

文庫轉(zhuǎn)化物鋪至大平板7～10 d以后，從37 ℃半乳糖平板上共挑取了62個克隆，將細(xì)胞重鋪在SD/glucose (-UL)瓊脂平板上，在25℃孵育5 d。大部分細(xì)胞可長出克隆，將長出的克隆的細(xì)胞分別復(fù)制接種在一個SD/glucose (-UL) 平板和一個SD/galactose (-UL) 平板上，37 ℃孵育約5 d。在SD/galactose (-UL)平板上生長，而在SD/glucose (-UL)平板上不生長的克隆為陽性克隆。經(jīng)過兩輪驗(yàn)證之后，共有10個克隆被初步確定為陽性克隆。擴(kuò)增前一步得到的10種含有陽性克隆的酵母細(xì)胞后，提取其中含有的文庫質(zhì)粒DNA。轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-blue感受態(tài)細(xì)胞后，小量提取質(zhì)粒。用EcoRI和XhoI雙酶切鑒定，得到的外源片斷從相對分子量0.5×103到1.8×103不等，如圖5。

圖5 純化質(zhì)粒的酶切電泳結(jié)果

五、陽性文庫質(zhì)粒與誘餌質(zhì)?；剞D(zhuǎn)驗(yàn)證

將篩選得到的陽性文庫質(zhì)粒和誘餌質(zhì)粒，共轉(zhuǎn)化到酵母感受態(tài)細(xì)胞中。將每個轉(zhuǎn)化反應(yīng)鋪在SD/glucose(-UL) 平板上，25 ℃倒置孵育5 d。在每個平板上挑取2個菌落，并將其重鋪在一個SD/glucose (-UL) 平板和一個SD/galactose(-UL) 平板上，在37 ℃孵育約48 h。在SD/galactose (-UL)平板上生長，而在SD/glucose (-UL)平板上不生長的克隆可以驗(yàn)證蛋白之間的相互作用。實(shí)驗(yàn)組10個克隆在37 ℃孵育48 h后，4種克隆在SD/galactose (-UL)平板上可以生長，而在SD/glucose (-UL)平板上不能生長，其余6種克隆在兩種平板上均無法生長，提示以上4種克隆與Clathrin蛋白之間存在相互作用，如圖6。4種陽性送檢測序。

圖6 陽性克隆回轉(zhuǎn)驗(yàn)證結(jié)果

六、陽性測序結(jié)果

將陽性克隆2，4，5，8送測序，并通過生物信息學(xué)軟件對測序結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果如下：

克隆2：Mus musculus adenylate cyclase-associated protein 1 (yeast)

克隆4：Mus musculus filamin, alpha

克隆5：Mus musculus DAP kinase-related apoptotic kinase 2 (Drak2)/Mus musculus serine/threonine kinase 17b (apoptosis-inducing) (Stk17b)

克隆8：Mus musculus G protein-coupled receptor kinase 6 (Grk6), transcript variant 1, mRNA

討 論

酵母雙雜交系統(tǒng)由Fields和Song等首先在研究真核基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中建立。典型的真核生長轉(zhuǎn)錄因子等都含有二個不同的結(jié)構(gòu)域：DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA-binding domain, BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(transcription-activating domain, AD)。前者可識別DNA上的特異序列，并使轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域定位于所調(diào)節(jié)的基因的上游，轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域可同轉(zhuǎn)錄復(fù)合體的其他成分作用，啟動它所調(diào)節(jié)的基因的轉(zhuǎn)錄。酵母雙雜交技術(shù)即利用上述特性，將酵母的轉(zhuǎn)錄因子的兩個功能域分解，由編碼BD和AD的DNA片段與需要研究的蛋白質(zhì)(X和Y)的cDNA分別構(gòu)建重組體BD-X和AD-Y。如果蛋白質(zhì)X和Y之間存在相互作用，則BD和AD被拉近，轉(zhuǎn)錄活性恢復(fù)，即可激活下游報告基因的表達(dá)[3]。因此應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)可以分析已知蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。

通過酵母雙雜交技術(shù)篩選的與已知蛋白相互作用的蛋白質(zhì)，其功能往往密切相關(guān)，彼此相互調(diào)節(jié)，共同參與某些病理生理過程，這對于闡明各種生物現(xiàn)象的分子機(jī)理和基因作用機(jī)制具有重要意義。本研究應(yīng)用pSos酵母雙雜交篩選系統(tǒng)，以pSos-Clathrin為誘餌質(zhì)粒篩選小鼠肺cDNA 文庫，得到與Clathrin相互作用的4種蛋白質(zhì)，并在酵母細(xì)胞中初步驗(yàn)證了它們的相互作用。

在這篩選到的4種蛋白質(zhì)中，腺苷酸環(huán)化酶關(guān)聯(lián)蛋白1(CAP1)首先是在酵母中發(fā)現(xiàn)的。CAP能和肌動蛋白單體結(jié)合，肌動蛋白是細(xì)胞保持形態(tài)和細(xì)胞運(yùn)動的基本單位，肌動蛋白的單體通過聚合和解聚，完成細(xì)胞的運(yùn)動。在肌動蛋白由單體組合成多聚體及多聚體解聚成單體的循環(huán)利用過程中，CAP發(fā)揮了重要作用?；蚯贸鼵AP1后，細(xì)胞肌動蛋白的裝配速度明顯減慢[4]，在酵母細(xì)胞敲除CAP1后，體積增大，出芽模式不規(guī)則，肌動蛋白的裝配也會紊亂[5]。而敲除了CAP1后Dictyostelium(一種真菌)會出現(xiàn)細(xì)胞極性的改變[6]。果蠅的CAP缺失也會影響其卵細(xì)胞極性的維持[7]。以上資料表明CAP1表達(dá)的異常使得肌動蛋白裝配紊亂，進(jìn)而影響細(xì)胞的形態(tài)、極性和遷徙。

細(xì)絲蛋白ɑ(Filamin ɑ)作為非肌性肌動蛋白結(jié)合蛋白，結(jié)構(gòu)保守，表達(dá)廣泛。細(xì)絲蛋白ɑ主要通過動態(tài)調(diào)節(jié)肌動蛋白的聚合、解聚、分支、交聯(lián)和捆束參與細(xì)胞骨架的動態(tài)重構(gòu)，改變細(xì)胞的形態(tài)和運(yùn)動以應(yīng)對外界刺激，定向細(xì)胞運(yùn)動在胚胎發(fā)育期間的機(jī)體器官發(fā)育過程中具有重要意義[8]。

DAP凋亡誘導(dǎo)蛋白激酶2(DRAK2)屬于死亡相關(guān)蛋白激酶家族(DAP kinase, DAPK)，是一類新的鈣離子/鈣調(diào)素依賴激酶，使其底物蛋白的絲氨酸/蘇氨酸殘基磷酸化。研究表明DRAK2與T細(xì)胞免疫和細(xì)胞凋亡有關(guān)[9-10]。

G蛋白耦聯(lián)受體激酶(G protein-coupled receptor kinase,GRK)是一類絲/蘇氨酸蛋白激酶。至今已克隆出7種亞型的GRK，其中GRK6 廣泛分布于心臟、腦、肺和胎盤等各種組織。研究表明GRK6 與炎癥調(diào)控、凋亡細(xì)胞的清除、腫瘤發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移以及藥物成癮性等有關(guān)[11-14]。

通過酵母雙雜交篩選的4種與Clathrin相互作用蛋白的可靠性可進(jìn)一步通過免疫共沉淀技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證，但其相互作用機(jī)制，包括極性損傷和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡等尚有待深入研究。

參 考 文 獻(xiàn)

1 金發(fā)光. 急性肺損傷的診治研究現(xiàn)狀及進(jìn)展[J/CD]. 中華肺部疾病雜志： 電子版， 2013， 6(1)： 1-3.

2 Deborde S, Perret E, Gravotta D, et al. Clathrin is a key regulator of basolateral polarity[J]. Nature, 2008, 452 (7188): 719-723.

3 Fields S, Sternglanz R. The two-hybrid system: an assay for protein-protein interactions[J]. Trends Genet, 1994, 10(8): 286-292.

4 Bertling E, Hotulainen P, Mattila PK, et al. Cyclase-associated protein 1 (CAP1) promotes cofilin-induced actin dynamics in mammalian nonmuscle cells[J]. Mol Biol Cell, 2004, 15(5): 2324-2334.

5 Gerst JE, Ferguson K, Vojtek A, et al. CAP is a bifunctional component of the Saccharomyces cerevisiae adenylyl cyclase complex[J]. Mol Cell Biol, 1991, 11(3): 1248-1257.

6 Noegel AA, Blau-Wasser R, Sultana H, et al. The Cyclase-associated Protein CAP as regulator of cell polarity and cAMP signaling in dictyostelium[J]. Mol Biol Cell, 2004, 15(2): 934-945.

7 Baum B, Perrimon N. Spatial control of the actin cytoskeleton in Drosophila epithelial cells[J]. Nat Cell Biol, 2001, 3(10): 883-890.

8 Pollard TD, Borisy GG. Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments[J]. Cell, 2003, 112(4): 453-465.

9 Weist BM, Hernandez JB, Walsh CM. Loss of DRAK2 signaling enhances allogeneic transplant survival by limiting effector and memory T cell responses[J]. Am J Transplant, 2012, 12(8): 2220-2227.

10 Mao J, Luo H, Wu J. Drak2 overexpression results in increased beta-cell apoptosis after free fatty acid stimulation[J]. J Cell Biochem, 2008, 105(4): 1073-1080.

11 Tarrant TK, Rampersad RR, Esserman D, et al. Granulocyte chemotaxis and disease expression are differentially regulated by GRK subtype in an acute inflammatory arthritis model (K/BxN)[J]. Clin Immunol, 2008, 129(1): 115-122.

12 Nakaya M, Tajima M, Kosako H, et al. GRK6 deficiency in mice causes autoimmune disease due to impaired apoptotic cell clearance[J]. Nat Commun, 2013, 4: 1532.

13 Raghuwanshi SK, Smith N, Rivers EJ, et al. G protein-coupled receptor kinase 6 deficiency promotes angiogenesis, tumor progression, and metastasis[J]. J Immunol, 2013, 190(10): 5329-5336.

14 Raehal KM, Schmid CL, Medvedev IO, et al. Morphine-induced physiological and behavioral responses in mice lacking G protein-coupled receptor kinase 6[J]. Drug Alcohol Depend, 2009, 104(3): 187-196.