林斌等

[摘要]目的研究浙江溫州地區(qū)漢族人群中染色體9p21上的rs1333049位點上的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）與冠心病的相關性。方法對冠心病組（至少1支主要冠狀動脈內徑狹窄≥50.00%）181例和對照組173例，采用聚合酶鏈反應和基因測序方法，檢測染色體9p21上rs1333049位點基因多態(tài)性。結果3種基因型均可在rs1333049位點上檢測到，并且其基因型的分布亦符合Hardy_Weinberg平衡定律。冠心病組rs13330149位點的CC、CG基因型分布及C等位基因頻率均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（均P<0.01）。結論rs1333049位點G/C基因的多態(tài)性與冠心病發(fā)病相關，其中的C等位基因亦可能是浙江溫州地區(qū)漢族人群冠心病患者的易感性標志之一。

[關鍵詞]冠狀動脈粥樣硬化性心臟病；染色體9p21；單核苷酸多態(tài)性

中圖分類號：R541.4文獻標識碼：A文章編號：1009_816X（2014）04_0298_03

doi：10.3969/j.issn.1009_816x.2014.04.10冠心病是成年人死亡的重要原因，隨著社會、經(jīng)濟的發(fā)展和變化，我國冠心病的發(fā)病率呈上升趨勢。目前，大家普遍認為冠心病是由多種遺傳因素和各種高危因素（疾病）共同作用而導致的多基因遺傳性疾病。然而，得到確認的有關遺傳因素對冠心病的影響研究成果并不多。近來，全基因組相關研究（genome_wide association studies GWAS）檢測了成百上千個標志物或者重點相關基因，其中包含冠心病的易患基因和其多態(tài)性的研究。WTCCC[1]（The Wellcome Trust Case Control Consortium）等發(fā)現(xiàn)人類9號染色體上的9p21.3區(qū)域上的基因和冠心病發(fā)病顯著相關。本文對354例冠狀動脈造影檢查患者進行了9p21區(qū)域多態(tài)位點rs1333049位點上的基因進行基因多態(tài)性測定，以探討其是否與浙江溫州地區(qū)漢族人群中的冠心病發(fā)病相關。

1資料與方法

1.1一般資料：入選對象均為2010年8月至2013年3月本院心內科的住院患者。所有患者入院后均常規(guī)檢測總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、血糖（Glu），并行冠狀動脈造影檢查。左右冠狀動脈主干、回旋支、前降支及其主要分支中任何一支血管直徑狹窄程度≥50%為冠狀動脈造影陽性。依據(jù)造影結果分為兩組：（1）冠心病組：共181例，男112例，女69例，年齡38～84歲，平均（64.76±10.59）歲。（2）對照組：冠狀動脈造影陰性，共173例，男105例，女68例，年齡35～81歲，平均（63.20±11.33）歲。所有患者均為溫州本地長期居住者，漢族且無親緣關系，并排除腦血管病、外周血管病、惡性腫瘤病史者。兩組患者年齡、性別等一般臨床資料，比較差異無統(tǒng)計學意義，見表1。

1.2方法：

1.2.1染色體基因組DNA的采集：在征得患者或其家屬的同意后，從外周靜脈采取5ml的靜脈血，置于常規(guī)抗凝管中（應用酸性的檸檬酸葡萄糖抗凝）。并取得白細胞（應用低滲溶血法），并提取基因組DNA，TE溶解（采用常規(guī)的酚/氯仿抽提法），并置于-20℃低溫的冰箱中保存。

1.2.2引物設計：引物采用Primier 5軟件自行設計，rs1333049上游引物：5'_GGCTGCTGACTCTGAAGATC_3'，下游引物：5'_CTTGCTTACCTCTGCGAGTG_3'，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.39p21基因聚合酶鏈反應（PCR）：擴增總體積為50μL，其中引物1.0μmol/L。擴增條件：95℃ 5min，92℃50s，60℃50s，72℃50s，72℃5min，共35個循環(huán)。PCR產物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4基因測序：PCR產物送長沙三濟生物科技有限公司純化后，采用ABI3730XLDNA分析系統(tǒng)進行測序分析。

1.3統(tǒng)計學處理：應用SPSS17.0版中文軟件包進行統(tǒng)計分析。計量資料以（x-±s）表示，組間比較采用t檢驗；等位基因頻率和基因型采用基因計數(shù)法進行統(tǒng)計計算，對基因型資料進行遺傳平衡檢驗（采用Hardy_Weinberg法）；單個基因型及基因組組間的等位基因頻率比較采用卡方檢驗，rs1333049基因多態(tài)性和冠心病的相關性采用多因素Logistic回歸分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.19p21區(qū)域rs1333049位點多態(tài)性分析：rs1333049位點PCR擴增結果見圖1?；驕y序結果可見CC、CG及GG三種基因型。冠心病組和對照組的rs1333049位點上的觀察數(shù)與期望數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），表明本研究的人群符合Hardy_Weinberg平衡定律。

3討論

冠心病是一種由多種遺傳因素和各種高危因素（疾?。┕餐饔枚鴮е碌亩嗷蜻z傳性疾病。年齡、性別、肥胖、高血壓、高脂血癥、糖尿病，吸煙等均是冠心病患病的重要危險因素[2]。但近年來，有研究表明基因在冠心病發(fā)病中扮演重要角色。關注于冠心病和心肌梗死所涉及的全基因組相關研究（GWAS）觀察發(fā)現(xiàn)，冠心病和心肌梗死相關位點在染色體9p21位點最為常見。WTCCC研究入選了1926例冠心病病例以及2938例對照組病例，采用Affymetrix 500K基因芯片，在世界上首次發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點rs1333049（位于9p21.3區(qū)域）與高加索人群冠心病的發(fā)病呈顯著相關[1]。Schunkert H等薈萃分析了7個歐洲人群和參加早先冠心病全基因組相關研究的4個人群，證實了rs1333049位點的多態(tài)性與冠心病的發(fā)病關系明顯相關[3]。此后該位點SNP和冠心病易感性的關聯(lián)也相繼在其它國家的其它人種人群中得到了印證。Hinohara等研究發(fā)現(xiàn)韓國和日本人群中染色體9p21區(qū)域上的rs1333049位點SNP和冠心病易感性的相關[4，5]。而中國的學者Wang等所做的研究結果亦提示rs1333049位點CC表型與中國漢族人群冠心病的早發(fā)性和嚴重性密切有關，且與患者的血糖，血胰島素水平及炎癥因子無關[6]。杜蓉等報道rs1333049位點CC與CG基因型為新疆維族人群心肌梗死的易感相關危險基因型[7]。本研究中所發(fā)現(xiàn)的冠心病患者和對照組患者的rs1333049位點基因型頻率分布有顯著差異（P<0.01），冠心病患者中的C等位基因的頻率明顯高于對照組（P<0.01），提示rs1333049位點多態(tài)性與冠心病的發(fā)病相關，C等位基因可能是浙江溫州地區(qū)漢族人群冠心病發(fā)病的易感因素之一。

在染色體9p21上發(fā)現(xiàn)的且與冠心病關系密切的SNPs主要集中在染色體9p21.3的區(qū)域內。該區(qū)域存在2種抑癌基因CDKN2A和CDKN2B，分別編碼細胞周期蛋白激酶抑制子CDK4家族中的抑制子p16NK4a、p15NK4b，在多種細胞增殖、衰老和凋亡中起重要作用[8～11]，而細胞增殖、衰老和凋亡是動脈粥樣硬化形成的主要特征之一，而動脈粥樣硬化是冠心病的病理基礎。Cunnington等研究表明9p21.3位點基因可能影響細胞周期激酶抑制因子4b位點的反義非編碼RNA ANRIL的調節(jié)，進而調節(jié)CDKN2A和CDKN2B的表達，這種調節(jié)可能促進細胞的增殖，引起動脈粥樣硬化性改變[12]。

總之，SNP位點的突變型在不同人種，民族中的差異較大，并且其易感位點亦不同，而且目前世界上對染色體9p21上SNP位點如何影響患者患病機制尚不明確，根據(jù)本研究的結果，我們推測其可能作為一種遺傳標志，通過其鄰近的基因發(fā)揮作用，關于SNP影響冠心病患病機制有待進一步研究。

參考文獻

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[12]Cunnington MS， Keavney B. Genetic mechanisms mediating atherosclerosis susceptibility at the chromosome 9p21 locus[J]. Curr Atheroscler Rep，2011，13（3）：193-201.

（收稿日期：2014_4_7）

在染色體9p21上發(fā)現(xiàn)的且與冠心病關系密切的SNPs主要集中在染色體9p21.3的區(qū)域內。該區(qū)域存在2種抑癌基因CDKN2A和CDKN2B，分別編碼細胞周期蛋白激酶抑制子CDK4家族中的抑制子p16NK4a、p15NK4b，在多種細胞增殖、衰老和凋亡中起重要作用[8～11]，而細胞增殖、衰老和凋亡是動脈粥樣硬化形成的主要特征之一，而動脈粥樣硬化是冠心病的病理基礎。Cunnington等研究表明9p21.3位點基因可能影響細胞周期激酶抑制因子4b位點的反義非編碼RNA ANRIL的調節(jié)，進而調節(jié)CDKN2A和CDKN2B的表達，這種調節(jié)可能促進細胞的增殖，引起動脈粥樣硬化性改變[12]。

總之，SNP位點的突變型在不同人種，民族中的差異較大，并且其易感位點亦不同，而且目前世界上對染色體9p21上SNP位點如何影響患者患病機制尚不明確，根據(jù)本研究的結果，我們推測其可能作為一種遺傳標志，通過其鄰近的基因發(fā)揮作用，關于SNP影響冠心病患病機制有待進一步研究。

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（收稿日期：2014_4_7）

在染色體9p21上發(fā)現(xiàn)的且與冠心病關系密切的SNPs主要集中在染色體9p21.3的區(qū)域內。該區(qū)域存在2種抑癌基因CDKN2A和CDKN2B，分別編碼細胞周期蛋白激酶抑制子CDK4家族中的抑制子p16NK4a、p15NK4b，在多種細胞增殖、衰老和凋亡中起重要作用[8～11]，而細胞增殖、衰老和凋亡是動脈粥樣硬化形成的主要特征之一，而動脈粥樣硬化是冠心病的病理基礎。Cunnington等研究表明9p21.3位點基因可能影響細胞周期激酶抑制因子4b位點的反義非編碼RNA ANRIL的調節(jié)，進而調節(jié)CDKN2A和CDKN2B的表達，這種調節(jié)可能促進細胞的增殖，引起動脈粥樣硬化性改變[12]。

總之，SNP位點的突變型在不同人種，民族中的差異較大，并且其易感位點亦不同，而且目前世界上對染色體9p21上SNP位點如何影響患者患病機制尚不明確，根據(jù)本研究的結果，我們推測其可能作為一種遺傳標志，通過其鄰近的基因發(fā)揮作用，關于SNP影響冠心病患病機制有待進一步研究。

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（收稿日期：2014_4_7）