★ 黃曉巧 李養(yǎng)學(xué) 胥愛麗 李素梅

(1.廣東省第二中醫(yī)院 廣東 廣州 510095；2.廣東省中醫(yī)研究所 廣東 廣州 510095)

復(fù)方紅黃洗劑由白芷、黃柏、干姜、側(cè)柏葉等中藥組成，具有清熱解毒、燥濕止癢、活血化瘀、益發(fā)生發(fā)之功效，主要用于斑禿、脂溢性脫發(fā)、頭皮發(fā)癢、頭屑多等癥。為了更好地控制產(chǎn)品質(zhì)量，保證臨床療效，對(duì)復(fù)方紅黃洗劑中的白芷、黃柏、干姜、側(cè)柏葉4味藥材進(jìn)行了定性鑒別，并采用高效液相色譜法對(duì)本品中白芷的有效成分歐前胡素進(jìn)行了含量測(cè)定，為該制劑建立完善的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 CAMAG TLC SAMPLER 4型自動(dòng)點(diǎn)樣儀；CAMAG TLC Visualizer型薄層成像系統(tǒng)；Waters 2695-2998高效液相色譜儀(PAD二級(jí)管陣列檢測(cè)器)；Kromasil C18色譜柱(4.6mm×250mm，5μm)；Mettler Toledo XS205DU電子天平；DHG-9070A電熱鼓風(fēng)干燥箱；SPX-150C型溫恒濕培養(yǎng)箱；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器。

1.2 材料 復(fù)方紅黃洗劑(批號(hào)：20130401、20130402、20130403)由廣東省第二中醫(yī)院制劑室提供。歐前胡素對(duì)照品(批號(hào)：110826-201013)、白芷對(duì)照藥材(批號(hào)：120945-200707)、黃柏對(duì)照藥材(批號(hào)：121510-200703)、干姜對(duì)照藥材(批號(hào)：120942-200606)、側(cè)伯葉對(duì)照藥材(批號(hào)：121396-200401)均購于中國食品藥品檢定研究院。乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，試驗(yàn)用水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 白芷的鑒別[1]取本品5mL，置蒸發(fā)皿中，加硅藻土適量吸附，蒸干，轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，加乙醚10mL，浸泡1h，時(shí)時(shí)振搖，濾過，濾液揮干，殘?jiān)右宜嵋阴?mL使溶解，作為供試品溶液。另取白芷對(duì)照藥材1g，加乙醚10mL，同法制成白芷對(duì)照藥材溶液。再取歐前胡素對(duì)照品、異歐前胡素對(duì)照品，加乙酸乙酯制成每1mL各含1mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各4μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(30～60℃)-乙醚(3∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

2.1.2 黃柏的鑒別[1]取本品2mL，置蒸發(fā)皿中，加硅藻土適量吸附，蒸干，轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，加1%醋酸甲醇溶液40mL，60℃超聲處理20min，濾過，濾液濃縮至2mL，作為供試品溶液。另取黃柏對(duì)照藥材0.5g，加1%醋酸甲醇溶液40mL，同法制成黃柏對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述2種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15∶1∶1∶2)為展開劑[2,3]，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。

2.1.3 干姜的鑒別[2]取本品20mL，用正丁醇振搖提取2次，每次20mL，合并正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液。另取干姜對(duì)照藥材1g，加水100mL，煮沸1h，冷卻，濾過，濾液用正丁醇振搖提取2次，每次20mL，同法制成干姜對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(2∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以香草醛硫酸試液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置日光下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性無干擾。

2.1.4 側(cè)柏葉的鑒別[3]取本品12mL，置蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，加硅藻土適量吸附，轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，加水25mL，再加鹽酸3mL，水浴加熱水解30min，立即冷卻，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次20mL，合并乙酸乙酯液，用水洗滌3次，每次10mL，棄去水液，乙酸乙酯液蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液。另取側(cè)柏葉對(duì)照藥材1g，加水25mL，再加鹽酸3mL，同法制成側(cè)柏葉對(duì)照藥材溶液。再取槲皮素對(duì)照品，加乙醇制成每1mL含0.1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010年版一部附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各3μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5∶2∶1)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鋁乙醇溶液，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照品和對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

2.2 含量測(cè)定[1]

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取歐前胡素對(duì)照品12.30mg，置于50mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，精密吸取10mL，置于100mL容量瓶中，加甲醇至刻度，即制得每1mL含歐前胡素24.5016μg的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品4mL，置蒸發(fā)皿中，加硅藻土適量吸附，蒸干，轉(zhuǎn)移至50mL量瓶中，加甲醇45mL，超聲處理(功率300W，頻率50kHz)1h，取出，放冷，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 取缺白芷的陰性樣品4mL，按3.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法制成白芷陰性對(duì)照溶液。

2.2.4 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性條件 色譜柱：Kromasil-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈-水(48∶52)[5]；檢測(cè)波長為254nm；流速：1.0mL/min；柱溫：25℃。在上述色譜條件下，歐前胡素與其他成分能較好分離，陰性對(duì)照溶液在歐前胡素對(duì)照品相同保留時(shí)間位置上未見色譜峰，說明陰性對(duì)照無干擾，見圖1～3。

圖1 歐前胡素對(duì)照品HPLC圖譜

圖2 供試品HPLC圖譜

圖3 陰性對(duì)照HPLC圖譜

2.2.5 線性范圍的考察 精密量取“2.2.1”項(xiàng)下配制好的對(duì)照品溶液1，2，3，4，5mL，分別置于5mL量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，得歐前胡素的濃度分別為4.90032，9.80064，14.70096，19.60128，24.50160μg的對(duì)照品溶液。精密吸取上述溶液各10μL，按“2.2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定峰面積，并以峰面積(Y)對(duì)歐前胡素含量(X)進(jìn)行回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=4239.8X-9114.5(r=0.9999)。表明歐前胡素在49.0032ng～245.0160ng范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液10μL連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得峰面積積分值RSD<2%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品(批號(hào)：20130401)溶液，分別于0，2，4，8，12h進(jìn)樣10μL，測(cè)得樣品中歐前胡素峰面積值的RSD<2%，表明供試品溶液12h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品(批號(hào)：20130401)按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，按擬定的含量測(cè)定方法，分別精密吸取10μL進(jìn)樣，測(cè)得峰面積積分值并計(jì)算含量，得歐前胡素含量RSD<2%，表明本方法重現(xiàn)性較好。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品溶液(批號(hào)20130401)9份，每份精密量取2mL，分別精密加入一定量的歐前胡素對(duì)照品，按供試品制備與測(cè)定方法，計(jì)算平均回收率為99.30%，RSD為1.42%(n=9)，表明本含量測(cè)定方法準(zhǔn)確度高，方法可靠，結(jié)果見表1。

表1 歐前胡素加樣回收率測(cè)定結(jié)果(n=9)

2.2.10 樣品測(cè)定 取不同批次樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.4”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=2)

3 討論

3.1 采用現(xiàn)行版《中國藥典》一部白芷、黃柏項(xiàng)下的薄層鑒別方法分別對(duì)方中白芷、黃柏進(jìn)行鑒別，結(jié)果色譜斑點(diǎn)清晰，能檢出其特征斑點(diǎn)，且陰性無干擾。

3.2 在進(jìn)行干姜的薄層鑒別研究時(shí)，曾采用現(xiàn)行版《中國藥典》一部干姜項(xiàng)下薄層鑒別方法進(jìn)行鑒別，結(jié)果色譜斑點(diǎn)不清晰，分離效果欠佳，經(jīng)不斷摸索試驗(yàn)，改用正丁醇提取，并以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(2∶1)作為展開劑，結(jié)果色譜斑點(diǎn)清晰，分離較好，可用于本制劑中干姜的質(zhì)量控制。

3.3 對(duì)方中側(cè)柏葉的薄層色譜鑒別研究，也曾采用現(xiàn)行版《中國藥典》一部側(cè)柏葉項(xiàng)下薄層鑒別方法進(jìn)行鑒別，結(jié)果分離效果不佳，在參考文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，用鹽酸水解后再進(jìn)行提取，結(jié)果斑點(diǎn)清晰，分離度好。

3.4 方中白芷所含歐前胡素的含量測(cè)定方法，參考了《中國藥典》白芷項(xiàng)下的含量測(cè)定方法，其流動(dòng)相為甲醇-水(55∶45)，但因本制劑成分較復(fù)雜，用此流動(dòng)相時(shí)，所測(cè)成分未能與雜質(zhì)很好的分離，經(jīng)過條件摸索，將甲醇改為乙腈，并將比例調(diào)整為48∶52，分離效果顯著提高，歐前胡素色譜峰能達(dá)到基線分離，且空白對(duì)照無干擾，重現(xiàn)性良好。該方法簡(jiǎn)單易行，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可作為復(fù)方紅黃洗劑中歐前胡素的含量測(cè)定方法。

[1]國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典·一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

[2]肖林林.活血解痛膏的薄層色譜鑒別研究[J].中國現(xiàn)代藥物研究，2012,6(22):129-130.

[3]王淑英,吳啟端,林雙峰,等.舒金克喘膠囊中桑白皮、川貝母、厚樸、側(cè)柏葉的薄層色譜鑒別[J].中成藥，2006，28(4):601-602.