，

(1.成都軍區(qū)總醫(yī)院眼科，四川 成都 610083；2.第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院西南眼科醫(yī)院，重慶 400038)

高度近視合并糖尿病的患者一般不易發(fā)生糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)，或不會(huì)進(jìn)展成為增值性糖尿病視網(wǎng)膜病變。目前，高度近視所致視網(wǎng)膜血管網(wǎng)微結(jié)構(gòu)改變尚缺少相關(guān)研究報(bào)道。而高度近視是否通過穩(wěn)定血-視網(wǎng)膜內(nèi)屏障而影響DR早期改變，也有待動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)。因此，本研究擬觀察單純高血糖動(dòng)物及高血糖合并形覺剝奪性近視/弱視動(dòng)物模型眼視網(wǎng)膜在DR早期表現(xiàn)(血-視網(wǎng)膜內(nèi)屏障損傷)中的變化。本研究通過過碘酸-雪夫氏液(PAS)染色、免疫熒光標(biāo)記觀察比較高血糖小鼠與高血糖合并形覺剝奪的小鼠視網(wǎng)膜微血管形態(tài)學(xué)的改變。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

鏈脲菌素(STZ)由美國(guó)Invitrogen公司提供，胰蛋白酶由美國(guó)Alexis公司提供，雪夫氏液、過碘酸、HE試劑均由美國(guó)BBI公司提供，鬼筆環(huán)肽-FITC由美國(guó)Sigma公司提供，DAPI試劑由北京碧云天公司提供，血糖儀及試紙均為羅氏公司產(chǎn)品，共聚焦熒光顯微鏡為L(zhǎng)eica公司產(chǎn)品，光學(xué)顯微鏡為日本Olympus公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 形覺剝奪性近視/弱視小鼠模型的建立及分組 BALB/cJ小鼠(1月齡)10只(購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，作為正常對(duì)照組(Ⅰ組)，BALB/cJ乳鼠(生后10 d)40只，分為2組，每組20只，其中10只用于PAS染色，10只用于鬼筆環(huán)肽-FITC免疫熒光雙標(biāo)觀察。Ⅱ組為高血糖組，Ⅲ組為高血糖合并形覺剝奪性近視/弱視組。乳鼠均由母鼠喂養(yǎng)，成年后(生后30 d)即給予正常飼養(yǎng)；高血糖組小鼠于出生后30 d經(jīng)左下腹小量、多次注射STZ；高血糖合并形覺剝奪性近視/弱視組于生后10 d縫合右眼瞼，生后30 d經(jīng)左下腹小量、多次注射STZ。3組小鼠自生后37 d起每日1次取尾血測(cè)量血糖，生后第72～77天齡時(shí)，稱量體質(zhì)量，乙醚麻醉，于暗室下檢影驗(yàn)光，獲得小鼠眼球屈光度值。完成以上測(cè)量后，處死小鼠并取出視網(wǎng)膜置于4%多聚甲醛中固定。

1.2.2 小鼠視網(wǎng)膜血管網(wǎng)鋪片及染色 ①視網(wǎng)膜血管網(wǎng)消化和鋪片：取固定的視網(wǎng)膜，置于蒸餾水中浸泡；將視網(wǎng)膜置于pH 7.8的3%胰酶-tris緩沖液中，37 ℃消化至視網(wǎng)膜表層組織大部松脫；取出視網(wǎng)膜，浸泡于蒸餾水中，清洗直至僅剩半透明組織；將該組織轉(zhuǎn)移至載玻片上，烘片1 h。②PAS染色實(shí)驗(yàn)：配置PAS溶液；0.5%過碘酸氧化視網(wǎng)膜血管網(wǎng)鋪片10 min；沖洗2次，蒸餾水沖洗1次；將載玻片浸入schiff液中，避光20 min；亞硫酸鈉滴洗鋪片2次，蒸餾水洗1次；蘇木精淡染15 s后，二甲苯透明；封片保存。③鬼筆環(huán)肽-FITC、DAPI熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)：將鬼筆環(huán)肽-FITC加入0.1%PBS中稀釋至5 μg/mL；每張鋪片滴加1% Triton 20 μl，浸泡破膜1 h；蒸餾水沖洗并晾干；每張鋪片滴加稀釋的鬼筆環(huán)肽-FITC 20 μl，置于避光濕盒中，孵育3 h；避光條件下蒸餾水沖洗鋪片并晾干；每張血管網(wǎng)鋪片滴加DAPI 20 μl，置于濕盒中，避光，孵育5 min；避光，蒸餾水沖洗血管網(wǎng)鋪片并晾干，抗熒光淬滅封片劑封片。

1.2.3 小鼠視網(wǎng)膜血管網(wǎng)內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞計(jì)數(shù) 光學(xué)顯微鏡下周細(xì)胞核位于血管外，呈短棒狀，染色較深，內(nèi)皮細(xì)胞核位于血管內(nèi)，呈長(zhǎng)梭狀，染色較淺。激光共聚焦層掃時(shí)，每張視網(wǎng)膜血管網(wǎng)鋪片采集9個(gè)點(diǎn)，可見周細(xì)胞核位于血管周圍，呈短棒狀或小三角狀，有時(shí)可與內(nèi)皮細(xì)胞核重疊，內(nèi)皮細(xì)胞核位于血管內(nèi)，呈長(zhǎng)梭狀或棒狀。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 PAS染色下周細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞

視網(wǎng)膜血管網(wǎng)鋪片上(圖1)周細(xì)胞核呈短棒狀，染色較深，位于血管周圍，內(nèi)皮細(xì)胞核呈長(zhǎng)梭形，染色較淺，位于管腔內(nèi)。高血糖組鋪片可見無細(xì)胞結(jié)構(gòu)血管。高血糖合并形覺剝奪組小鼠視網(wǎng)膜鋪片則較少見到無細(xì)胞結(jié)構(gòu)血管。

高血糖組小鼠內(nèi)皮細(xì)胞/周細(xì)胞比值(圖2)較對(duì)照組顯著增高(P<0.01)，說明高血糖組小鼠視網(wǎng)膜血管網(wǎng)周細(xì)胞凋亡顯著增多，高血糖合并形覺剝奪性近視/弱視組周細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞比值較單純高血糖組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，說明形覺剝奪性近視/弱視組周細(xì)胞凋亡減少。

a：正常對(duì)照組；b：高血糖組；c：高血糖合并形覺剝奪性近視/弱視組；↑：周細(xì)胞核；★：內(nèi)皮細(xì)胞核；▲：無細(xì)胞結(jié)構(gòu)血管

圖1小鼠視網(wǎng)膜血管網(wǎng)鋪片PAS染色形態(tài)學(xué)觀察(×1000)

*：與Ⅰ組比較，P<0.01；#：與Ⅲ組比較，P<0.01

2.2 鬼筆環(huán)肽-FITC/DAPI染色形態(tài)學(xué)觀察

3小鼠鬼筆環(huán)肽-FITC/DAPI染色下視網(wǎng)膜血管網(wǎng)形態(tài)學(xué)觀察見圖3。鬼筆環(huán)肽-FITC/DAPI染色與PAS染色的形態(tài)學(xué)比較見圖4。圖4b中左下方箭頭(↑)所指為一個(gè)與內(nèi)皮細(xì)胞核平行的周細(xì)胞核，形狀不典型，為類似于內(nèi)皮細(xì)胞核的梭形，但在共聚焦掃描下可以清晰地看到該細(xì)胞突出于血管腔之外；左上方箭頭(↑)所指為一個(gè)位于血管背面，難以辨認(rèn)的周細(xì)胞核，但通過層掃可以清楚地看到其熒光在血管腔之外，形狀呈典型的短棒狀；右上方箭頭(↑)所指為一個(gè)與內(nèi)皮細(xì)胞核重疊的周細(xì)胞核，在共聚焦掃描三維重建中可以看到此處實(shí)際上有一個(gè)較長(zhǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞核和一個(gè)突起的短棒狀周細(xì)胞核。

3 討論

血-視網(wǎng)膜內(nèi)屏障是DR主要的滲漏點(diǎn)[1]。血-視網(wǎng)膜內(nèi)屏障損傷在DR早期即可出現(xiàn)，主要表現(xiàn)為毛細(xì)血管基底膜增厚、周細(xì)胞凋亡等[2]。在胚胎血管成熟過程中，周細(xì)胞被認(rèn)為決定著從新生血管成熟的過程，內(nèi)皮細(xì)胞不能單獨(dú)完成血管形成過程[3]。血管形成后，周細(xì)胞通過多種細(xì)胞因子途徑被募集到新生的血管周圍，周細(xì)胞募集抑制將引起血管的異常重構(gòu)[4-5]，失去接觸抑制的內(nèi)皮細(xì)胞肥大，向管腔突出，堵塞管腔形成無細(xì)胞結(jié)構(gòu)血管，進(jìn)而導(dǎo)致視網(wǎng)膜無灌注區(qū)形成[6]。而內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂抑制的減弱，可導(dǎo)致微血管瘤形成。因此，周細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是高血糖視網(wǎng)膜損傷的特征性表現(xiàn)。視網(wǎng)膜毛細(xì)血管周細(xì)胞喪失可表現(xiàn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞/周細(xì)胞比值升高。因此本研究使用內(nèi)皮細(xì)胞/周細(xì)胞比值來間接反映周細(xì)胞的凋亡，并觀察到內(nèi)皮細(xì)胞/周細(xì)胞比值明顯上升出現(xiàn)在小鼠實(shí)驗(yàn)性高血糖早期。證實(shí)了在高血糖早期，已經(jīng)出現(xiàn)了血-視網(wǎng)膜內(nèi)屏障損傷。

a：正常對(duì)照組；b：高血糖組；c：高血糖合并形覺剝奪性近視/弱視組；↑：周細(xì)胞核；★：內(nèi)皮細(xì)胞核；▲：無細(xì)胞結(jié)構(gòu)血管

a：PAS染色；b：鬼筆環(huán)肽-FITC/DAPI染色；↑：周細(xì)胞核；★：內(nèi)皮細(xì)胞核；◆：難以辨別的細(xì)胞核

圖4小鼠視網(wǎng)膜血管網(wǎng)周細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞PAS染色及鬼筆環(huán)肽-FITC/DAPI染色(×1000)

Lim等[7]通過一項(xiàng)692例的臨床觀察發(fā)現(xiàn)，同時(shí)患有高度近視的糖尿病患者，較僅有糖尿病的患者其增殖性DR發(fā)生率明顯降低，其中，一眼患有高度近視，另一眼無明顯屈光不正的糖尿病患者，其患有高度近視的一眼不發(fā)生DR或僅發(fā)生非增殖性DR，這或許提示高度近視對(duì)DR的發(fā)生發(fā)展有延緩作用。這種作用可能與高度近視患者眼軸增長(zhǎng)，視網(wǎng)膜血流量減少，對(duì)血管的破壞也相應(yīng)減少有關(guān)，也可能與高度近視患者變薄的視網(wǎng)膜需氧量更少有關(guān)[8-9]。然而，另一些臨床觀察認(rèn)為，高度近視發(fā)病率較高的人群同樣也是DR高發(fā)的人群，提示高度近視與糖尿病視網(wǎng)膜病變并無相關(guān)性[10]。目前，高度近視對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜病變的保護(hù)作用尚缺乏動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)。本研究證實(shí)形覺剝奪組小鼠視網(wǎng)膜周細(xì)胞丟失輕于高血糖組，提示形覺剝奪性近視/弱視合并高血糖組小鼠血-視網(wǎng)膜內(nèi)屏障損傷較單純高血糖組更輕，為進(jìn)一步研究形覺剝奪性近視/弱視對(duì)高血糖視網(wǎng)膜損傷保護(hù)作用的可能機(jī)制和途徑打下基礎(chǔ)。但由于小鼠體質(zhì)量輕，持續(xù)高血糖導(dǎo)致其死亡率明顯上升。因此，本實(shí)驗(yàn)中觀察時(shí)間短，加長(zhǎng)病程的觀察還有待進(jìn)一步研究。另外，經(jīng)腹腔小量多次注射STZ造成高血糖被認(rèn)為是Ⅰ型糖尿病的經(jīng)典模型，而人類糖尿病視網(wǎng)膜病變多發(fā)生在Ⅱ型糖尿病患者。因此，Ⅱ型糖尿病合并形覺剝奪性近視/弱視動(dòng)物模型的視網(wǎng)膜微血管改變尚需進(jìn)一步研究。

此外，傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)中周細(xì)胞的識(shí)別主要依賴于其形態(tài)及與血管的毗鄰關(guān)系，但周細(xì)胞的排列、長(zhǎng)度、形態(tài)多變，因此PAS染色在光鏡下不能很好地區(qū)分周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。周細(xì)胞起源和功能具有多樣性，目前也沒有特異性的周細(xì)胞標(biāo)志物。因此，本實(shí)驗(yàn)采用了肌動(dòng)蛋白抗體鬼筆環(huán)肽和DAPI兩種無特異的抗體雙標(biāo)視網(wǎng)膜血管網(wǎng)，并采用激光共聚焦層掃后三維重建來計(jì)數(shù)周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。有利于觀察一些形態(tài)和位置不典型的周細(xì)胞核。該方法目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

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