張春香，秦 雪，鄭亞琳，張彩霞，岳文斌，任有蛇

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801)

卵母細(xì)胞成熟過程中受到許多基因及受體基因的調(diào)控，其中轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子β家族的基因，例如生長(zhǎng)分化因子9(GDF9)、骨形態(tài)蛋白15(BMP15)、BMP6直接或間接影響卵母細(xì)胞發(fā)育和成熟[1]，BMPs作用于顆粒細(xì)胞、卵母細(xì)胞，通過自分泌或旁分泌作用調(diào)節(jié)卵泡的生長(zhǎng)和發(fā)育[2]。Juengel等已在綿羊原始卵泡及處于不同發(fā)育階段的卵泡中發(fā)現(xiàn)表達(dá)有GDF9和BMP6 mRNA[3，4]。BMP15主要表達(dá)在初級(jí)卵母細(xì)胞階段[5]，可以增強(qiáng)卵母細(xì)胞發(fā)育的全能型[6]。GDF9、BMP15和BMP6可以增強(qiáng)顆粒細(xì)胞的有絲分裂活性[3，7]。GDF9、BMP15和BMP6在卵巢中發(fā)揮作用需與受體BMPRII、TGFBR1和BMPR1B結(jié)合，激活絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶相級(jí)聯(lián)的信號(hào)通路。另外。卵丘細(xì)胞特異性表達(dá)的前列腺素內(nèi)過氧化物酶2(Ptgs2)在體外成熟中也起重要作用，Dinchuk等[8]認(rèn)為，Ptgs2功能缺陷可能會(huì)導(dǎo)致卵母細(xì)胞不能成熟，具體表現(xiàn)為不排出第一極體。以上所述基因不僅與卵母細(xì)胞成熟有關(guān)，而且也是與高繁殖力相關(guān)的基因。目前這些研究主要集中在人、鼠、綿羊上，然而關(guān)于山羊卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)前后這些轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子β基因及其受體表達(dá)特性的研究還未見報(bào)道。本試驗(yàn)以晉嵐絨山羊6～8周齡母羔為供體，通過超數(shù)排卵獲取未成熟卵母細(xì)胞，經(jīng)體外成熟培養(yǎng)后，比較分析卵母細(xì)胞成熟前后卵泡發(fā)育相關(guān)基因和受體基因的表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

1.1.1 卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體的收集 本試驗(yàn)選用6～8周齡、健康狀況良好、體重相近的3只晉嵐絨山羊母羔作為超數(shù)排卵對(duì)象，每天注射2次FSH(BIONICHE Animal Health Canada INC)，每次4 mg，連續(xù)注射2 d，最后1次加注400 IU PMSG(寧波三生藥業(yè)有限公司)。采用手術(shù)活體取卵，然后在體視鏡下檢出形態(tài)正常的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，記錄每只羔羊所獲得未成熟卵母細(xì)胞數(shù)。試驗(yàn)用母羔由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院生態(tài)畜牧站提供。

1.1.2 卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)及收集 將檢出的COCs用預(yù)熱的采卵液(9.5 mg/mL TCM199，5.958 mg/mL hepes，2.2 mg/mL NaHCO3，10 μg/mL heparin，3 mg/mL BSA，0.05 mg/mL鏈霉素和0.06 mg/mL鏈霉素)沖洗3次，用成熟液(9.5 mg/mL TCM199、5.958 mg/mL hepes、2.2 mg/mL NaHCO3、10% FBS、0.3 mmol/L丙酮酸鈉、100 μg/mL谷氨酰胺、50 ng/mL IGF-I、10 μg/mL FSH，10 μg/mL LH、1 μg/mL E2、100 μg/mL鏈霉素和100 μg/mL鏈霉素)沖洗2次。將每只羔羊收獲的卵母細(xì)胞平均分為2份，其中1份將周圍顆粒細(xì)胞吹打后放入凍存管中，標(biāo)記，液氮中保存；另一份放入預(yù)平衡好的四孔板(成熟培養(yǎng)液600 μL，石蠟油280 μL)，于38.6 ℃、5%CO2和100%飽和濕度的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)后的細(xì)胞放入0.1%的透明質(zhì)酸酶中，吹打除去卵丘細(xì)胞為止。觀察卵母細(xì)胞，以排出第一極體作為卵母細(xì)胞成熟的標(biāo)志，檢出成熟卵母細(xì)胞，放入凍存管中，標(biāo)記，液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 RT-PCR定量分析

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 本試驗(yàn)熒光定量PCR所用引物中BMP6、BMP15、GDF9是引自Ebrahimi等[9]，Ptgs2、BMPRII、TGFβRI和BMPR1B引自Kyasari等[10]。18s內(nèi)參基因根據(jù)Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中DQ222453設(shè)計(jì)，引物序列見表1。引物由北京六合華大生物技術(shù)有限公司合成。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.2.2 卵母細(xì)胞RNA提取 按照Array PureTMNano-scale RNA Purification Kit說明書步驟提取卵母細(xì)胞的RNA，并用核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定RNA濃度和純度。根據(jù)PrimeScriptTMRT Master說明書，以RNA為模板合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 RT-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 卵母細(xì)胞樣本的cDNA 2×稀釋6個(gè)梯度，使每個(gè)PCR反應(yīng)體系中起始模板數(shù)分別為26、25、24、23、22、21，同時(shí)設(shè)不加cDNA空白管為陰性對(duì)照。根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒說明書建議的反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex TaqTM12.5 μl，cDNA模板2.0 μl，正反向引物各0.5 μl(18S rRNA 內(nèi)參和7個(gè)目的基因)，ddH2O 9.5 μl，總體積25 μl；95 ℃ 10 s變性，95 ℃ 5 s，63～64 ℃ 30 s，共44個(gè)循環(huán)，進(jìn)行熒光定量反應(yīng)，軟件自動(dòng)得出擴(kuò)增曲線、熔解曲線和循環(huán)閾值，分析所得結(jié)果。

1.2.4 目的基因RT-PCR反應(yīng) 3只羊的未成熟卵母細(xì)胞和成熟卵母細(xì)胞共6個(gè)樣本，每個(gè)樣本另設(shè)技術(shù)重復(fù)3次，進(jìn)行內(nèi)參基因和目的基因的相對(duì)定量分析。根據(jù)CT值和標(biāo)準(zhǔn)曲線來計(jì)算定量的結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

RT-PCR的試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用MX3000P導(dǎo)出。目的基因與內(nèi)參基因使用-△△CT法來獲得它們的相對(duì)表達(dá)量。使用SPSS17.0軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA提取與RT-PCR檢測(cè)

經(jīng)核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定卵母細(xì)胞總RNA的濃度和純度，所有樣品OD260/OD280均在1.8～2.0之間，這說明提取的總RNA質(zhì)量可靠，符合后續(xù)試驗(yàn)要求。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立與RT-PCR結(jié)果

圖1為軟件自動(dòng)生成的BMP15基因和內(nèi)參基因18 s RNA標(biāo)準(zhǔn)曲線，由圖可以看出，BMP15基因和內(nèi)參基因18 s RNA在6個(gè)數(shù)量級(jí)上呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸系數(shù)分別為0.999和0.998，擴(kuò)增效率分別為101.6%和105.5%，均在100%～110%之間，說明本試驗(yàn)建立的內(nèi)參基因18 s和目的基因的定量檢測(cè)方法是有效的。圖2為目的基因和內(nèi)參基因18 s RNA的 RT-PCR擴(kuò)增曲線，從圖可以看出，所有擴(kuò)增曲線的基線平穩(wěn)、拐點(diǎn)清楚、曲線整體的一致性和平行性良好，說明本試驗(yàn)建立的定量檢測(cè)的結(jié)果是可靠的。

圖1 BMP15和18 s rRNA標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 部分目的基因與18 s rRNA擴(kuò)增曲線

2.3 卵泡發(fā)育相關(guān)基因和受體基因的表達(dá)差異

體外成熟培養(yǎng)前后卵母細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因及其受體的表達(dá)情況見圖3和圖4。圖3為與卵母細(xì)胞發(fā)育相關(guān)基因BMP6、BMP15、GDF9和Ptgs2的相對(duì)表達(dá)量結(jié)果。從圖3可以看出，未成熟卵母細(xì)胞中GDF9和BMP15的mRNA表達(dá)量與成熟卵母細(xì)胞中的表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)。成熟卵母細(xì)胞中BMP6的mRNA表達(dá)量顯著高于未成熟卵母細(xì)胞的表達(dá)量(P<0.05)，然而成熟卵母細(xì)胞中Ptgs2的mRNA極顯著低于未成熟卵母細(xì)胞的表達(dá)量(P<0.01)。

圖3 BMP6、BMP15、GDF9和Ptgs2基因在山羊未成熟和成熟卵母細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量

圖4 TGFβRI、BMPRIB和BMPRII基因在山羊未成熟和成熟卵母細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量

圖4為其受體基因TGFβRI、BMPRII、BMPRIB的相對(duì)表達(dá)量結(jié)果。從圖4可以看出，卵母細(xì)胞成熟后，BMPRⅡ、TGFβRI和BMPRIB的表達(dá)量極顯著上調(diào)(P<0.01)。

3 討論

卵母細(xì)胞的成熟主要依賴于卵泡及卵泡周圍細(xì)胞RNA和蛋白質(zhì)的產(chǎn)生及積累。Sanchez等[11]結(jié)果顯示，家鼠卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)后BMP15和GDF9 mRNA表達(dá)量顯著降低。然而Assou等[12]結(jié)果顯示，人卵母細(xì)胞成熟后BMP15 mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)，GDF9 mRNA表達(dá)量顯著下調(diào)。Lequarre等[13]報(bào)道，肉牛卵母細(xì)胞成熟前后GDF9 mRNA表達(dá)量無(wú)顯著差異。本研究結(jié)果顯示山羊卵母細(xì)胞培養(yǎng)前后GDF9和BMP15的mRNA表達(dá)量差異不顯著，與綿羊卵母細(xì)胞培養(yǎng)前后GDF9和BMP15的mRNA表達(dá)量的變化趨勢(shì)基本一致[10]。然而本研究結(jié)果顯示BMP6 mRNA表達(dá)量顯著增加，而綿羊的在成熟培養(yǎng)前后其表達(dá)量差異不顯著。也就是說，不同動(dòng)物種類之間其卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)前后BMP15、GDF9和BMP6 mRNA表達(dá)量變化是有差異的。

Ptgs2主要表達(dá)在顆粒細(xì)胞中，對(duì)卵母細(xì)胞成熟有調(diào)控作用。本研究結(jié)果顯示Ptgs2基因在卵母細(xì)胞成熟后顯著下調(diào)，這說明其可能主要在未成熟卵母細(xì)胞中發(fā)揮作用。然而Kyasari等[10]結(jié)果顯示綿羊卵母細(xì)胞成熟前后Ptgs2 mRNA表達(dá)量差異不顯著。目前關(guān)于卵母細(xì)胞成熟前后Ptgs2 mRNA表達(dá)特性的研究較少，還有待進(jìn)一步深入研究和驗(yàn)證。

有研究顯示在綿羊卵母細(xì)胞成熟后BMPRIB 和BMPRⅡ mRNA表達(dá)量顯著增加，TGFβRI mRNA表達(dá)量無(wú)顯著差異[10]。而本研究結(jié)果顯示山羊卵母細(xì)胞成熟后BMPRIB、BMPRⅡ和TGFβRI三個(gè)受體的表達(dá)水平均顯著增加。BMPRⅡ可以作為BMP15、GDF9和BMP6的受體，其mRNA表達(dá)量增加可以直接增加BMP15、GDF9和BMP6的生物學(xué)作用；另一方面，成熟后BMP6表達(dá)量增加可能誘導(dǎo)其受體BMPRⅡ和BMPRIB的增加。TGFβRI在綿羊和山羊卵母細(xì)胞成熟前后的不一致性，需要進(jìn)一步的驗(yàn)證。

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