肖代雯,楊永長(zhǎng),騰飛鵬,劉 華,黃文芳

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其死亡率僅次于肺癌位于第二位[1]。目前乳腺癌治療的10年生存率尚無(wú)明顯改善，主是是因?yàn)榇蟛糠只颊甙l(fā)現(xiàn)時(shí)已到中晚期。因此，尋找乳腺癌診斷的特異性標(biāo)志物，對(duì)乳腺癌的診斷治療具有重要的意義。表面增強(qiáng)激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(surface enhanced laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry, SELDI-TOF MS)是近年發(fā)展起來(lái)的一種蛋白組學(xué)研究方法，利用這一技術(shù)可對(duì)血清、尿液、細(xì)胞裂解液和細(xì)菌等樣品進(jìn)行直接檢測(cè)，具有高靈敏性、高通量特點(diǎn)?，F(xiàn)已廣泛應(yīng)用于結(jié)腸癌、肺癌、糖尿病和細(xì)菌感染等疾病的診斷研究[2-5]。美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)和美國(guó)國(guó)立癌癥研究所(NCI)已應(yīng)用該技術(shù)建立了卵巢癌的診斷模型，并于2004年在美國(guó)開(kāi)始應(yīng)用于臨床卵巢癌的篩查。本實(shí)驗(yàn)擬應(yīng)用SELDI-TOF MS篩選乳腺癌的蛋白標(biāo)志物，建立診斷模型，為乳腺癌的快速診斷奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料 2007年10月-2008年2月我院收治的乳腺癌患者35例，乳腺良性病變患者35例。乳腺癌和乳腺良性病變患者血清都于術(shù)前收集，且均經(jīng)術(shù)后病理確診。另采集正常人血清18例。于清晨采集受試者血清3 ml,30 min內(nèi)放于4℃冰箱中，分出血清后4℃離心5 min，血清轉(zhuǎn)入一干凈EP管中，50 μl/管進(jìn)行分裝，凍存于-80℃冰箱中備用。

1.2方法 儀器及試劑：無(wú)水醋酸鈉(NaAc)、芥子酸(SPA)、乙腈(ACN)、三氟乙酸(TFA)，甲酸和蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Sigma公司；SELDI-TOF MS、CM10蛋白芯片、Proteinchip Software和Biomarker Pattern分析軟件購(gòu)自美國(guó)Ciphergen Biosystems。

1.2.1蛋白分子量校準(zhǔn) 采用Sigma蛋白標(biāo)準(zhǔn)品insulin(MW5733.49)，Cytochrome C(MW12 230), Myoglobin(16 950)對(duì)SELDI-TOF-MS進(jìn)行分子量校準(zhǔn)。

1.2.2CM10芯片的活化及標(biāo)本上樣 血清分為2組：乳腺癌組(包括35例乳腺癌)及對(duì)照組(包括35例乳腺良性病變患者及18例正常人)。CM10芯片裝入芯片處理器，每孔加入150 μl，50 mM醋酸鈉，振蕩5 min，甩干，重復(fù)1次；將芯片處理器置于冰上，每孔加入80 μl標(biāo)本，冰上振蕩1個(gè)小時(shí)；每孔加入150 μl,50mM醋酸鈉，振蕩5 min，甩干，重復(fù)3次；每孔加入150 μl HPLC水瞬時(shí)洗兩次，甩干；室溫自然干燥約15 min。

1.2.3血清蛋白質(zhì)譜的檢測(cè) 芯片干燥后，每孔加入1 μl SPA，室溫放置約15 min，自然干燥，重復(fù)1次。SELDI TOF MS測(cè)定血清蛋白，激光強(qiáng)度設(shè)為190，靈敏度為8，優(yōu)化相對(duì)分子質(zhì)量范圍3 000～20 000。采用Ciphergen proteinchip分析軟件自動(dòng)采集數(shù)據(jù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Ciphergen Biomaker Wizard軟件分析癌癥組和對(duì)照組血清蛋白指紋圖譜，設(shè)定有意義的蛋白質(zhì)峰出現(xiàn)頻率閾值為10%，信噪比設(shè)定為7，對(duì)不同組數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，P<0.01的蛋白質(zhì)峰差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用Biomarker Pattern軟件建立乳腺癌診斷的分類(lèi)樹(shù)模型。

2 結(jié)果

2.1血清蛋白質(zhì)圖譜的檢測(cè) 經(jīng)質(zhì)譜檢測(cè)和Ciphergen Proteinchip 3.0軟件分析，在質(zhì)荷比3 000～30 000范圍內(nèi)共檢測(cè)到59個(gè)蛋白質(zhì)峰，其中有19峰表達(dá)具有明顯差異(P<0.01),見(jiàn)表1及圖1。與對(duì)照組相比，有8個(gè)蛋白質(zhì)在乳腺癌中高表達(dá)，11個(gè)呈低表達(dá)。

表1 乳腺癌組與對(duì)照組5個(gè)蛋白質(zhì)峰比較

注：0對(duì)照組;1乳腺癌組。

A正常人 B乳腺良性病變 C和D 乳腺癌圖1 乳腺癌組與對(duì)照組部分蛋白質(zhì)峰比較

2.2乳腺癌診斷模型的建立 采用Biomarker Pattern軟件對(duì)差異蛋白進(jìn)行分析，以質(zhì)荷比為M6636.62，M13889.6建立的分類(lèi)樹(shù)診斷模型，診斷的準(zhǔn)確率達(dá)到94.3%,靈敏度和特異度分別為80.0%(28/35)和71.7%(38/53)。見(jiàn)圖2。

3 討論

乳腺癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，據(jù)中國(guó)腫瘤登記處統(tǒng)計(jì)，乳腺癌的死亡率排在中國(guó)城市女性腫瘤死亡率的第4位。乳腺癌的自然病程以臨床前期最長(zhǎng)，約占總病程的2/3，早期癌中大多無(wú)明顯包塊或腫塊較小，等出現(xiàn)明顯腫塊時(shí)，半數(shù)已有淋巴或血行轉(zhuǎn)移。目前乳腺癌的診斷檢查方法主要有：鉬靶攝片、選擇性乳腺導(dǎo)管造影、針吸細(xì)胞學(xué)檢查及分子生物學(xué)檢測(cè)等。這些方法對(duì)有明顯包塊的患者診斷率約為60%左右[6]，但對(duì)于腫塊直徑小于0.5 cm，準(zhǔn)確率極低。而乳腺癌血清標(biāo)志物，如CA153和CA27等，均存在表達(dá)水平低，敏感性和特異性差等問(wèn)題。因些，尋找一種高靈敏性、高特異性的診斷方法成為目前臨床的迫切需要。

圖2 乳腺癌的分類(lèi)樹(shù)診斷模型圖

目前，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究得到了空前的發(fā)展，出現(xiàn)了大量的研究方法并應(yīng)用于臨床，利用這些技術(shù)人們發(fā)現(xiàn)了許多的疾病標(biāo)志物[7-9]。其中，2002年諾貝爾化中學(xué)獎(jiǎng)獲得者田中發(fā)明了表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(SELDI-TOF-MS)，該技術(shù)在吸收傳統(tǒng)質(zhì)譜技術(shù)的基礎(chǔ)上，克服了常規(guī)蛋白組學(xué)檢測(cè)技術(shù)的一些缺點(diǎn)，具有檢測(cè)速度快，樣本用量小，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量范圍大，重復(fù)性較好，敏感性，特異性較高等特點(diǎn)。利用這一技術(shù)可對(duì)血清、尿液、細(xì)胞裂解液等生物樣品直接進(jìn)行檢測(cè)，能基本反映被檢樣本中蛋白質(zhì)的全貌，進(jìn)而可以發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)的變化，為疾病的早期診斷、復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的監(jiān)測(cè)提供了可能。

本研究利用SELDI-TOF-MS技術(shù)，選擇CM10蛋白芯片，對(duì)乳腺癌患者血清及對(duì)照組血清(包括乳腺良性病變及正常人)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行分析。研究證明乳腺癌組及對(duì)照組血清蛋白質(zhì)譜圖有19個(gè)蛋白峰表達(dá)具有明顯差異(P<0.01)。以2個(gè)蛋白質(zhì)峰(質(zhì)荷比分別為M6636.62，M13889.6)建立的診斷模型，對(duì)乳腺癌的診斷的準(zhǔn)確率達(dá)到94.3%,靈敏度和特異度分別為80.0%和71.7%。

應(yīng)用SELDI-TOF-MS技術(shù)可以提供大量完善動(dòng)態(tài)的蛋白指紋圖譜，在各種疾病的診斷和治療方面發(fā)揮一定的作用，隨著技術(shù)的不斷改進(jìn)和標(biāo)準(zhǔn)化，這一技術(shù)有望應(yīng)用于臨床，在人類(lèi)戰(zhàn)勝惡性疾病中發(fā)揮重要作用。

【 參 考 文 獻(xiàn) 】

[1] 胡 躍，張?zhí)K展，余捷凱，等.乳腺癌患者血清蛋白質(zhì)指紋圖譜檢測(cè)及其臨床意義[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2004，27(10)：646-648.

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