姚廷敬，張 暉，彭德峰，朱正志，馬小開，周 銳，朱金海，崔 振，王巖巖

甲狀腺未分化癌是甲狀腺中少見的惡性腫瘤，發(fā)病率不超過甲狀腺癌的5%，但病死率卻占甲狀腺癌的50%，甲狀腺未分化癌惡性程度高、預后差、死亡率高給患者的生活質(zhì)量帶來的具大的威脅[1]，因此，對于甲狀腺未分化癌的研究將為臨床診治、判斷預后等提供充足的理論基礎(chǔ)；microRNA是一類非編碼的小分子RNA，其通過在轉(zhuǎn)錄后水平與靶分子的mRNA結(jié)合達到調(diào)控蛋白表達的目的，在以往的研究中已證實microRNA幾乎參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等所有生物學活動[2]，但是當前對于microRNA與甲狀腺未分化癌的研究仍相對較少。因此本研究旨在通過納米粒轉(zhuǎn)染技術(shù)，以探究miRNA-30b對甲狀腺未分化癌細胞系TA-K細胞生物學特性的影響。

1 材料與方法

1.1材料 異佛爾酮二異氰酸酯、氯仿、聚醚酰亞胺(PEI)購至上海伍林化工有限公司；miRNA-30b序列、Caspase-3上下游引物由上海生工公司合成；TA-K細胞購至上海索萊寶生物科技有限公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購至Invitrogen公司；Survivin(Biolegend)抗體購于上?？浦斏锟萍脊?。

1.2方法

1.2.1miRNA-30b納米粒的制備 將mPEG與過量的異佛爾酮二異氰酸酯(IPDI)溶于氯仿，經(jīng)過催化、沉淀、干燥等得到異氰酸醋單端基聚乙二醇，然后將其加入至含PEI的氯仿中，加熱、沉淀，過濾、干燥得到PEG-PEI嵌段共聚物；化學合成miRNA-30b序列，將PEG-PEI納米共聚物與miRNA-30b復合形成負載miRNA-30b的PEG-PEI納米粒。Annexin V/PI試劑盒(法國國際免疫公司)。流式細胞儀(FACScan型美國BD公司)。

1.2.2miRNA-30b納米粒轉(zhuǎn)染TA-K細胞 應用脂質(zhì)體在lipofectamine2000條件下轉(zhuǎn)染miRNA-30b納米粒至甲狀腺未分化癌細胞系TA-K細胞，其方法如下：細胞鋪板含血清2 ml，密度為90%～95%，每孔細胞，使用250 ul無血清培養(yǎng)基(如OPTI-MEM I培養(yǎng)基)稀釋4.0 ugmiRNA-30b納米粒，輕輕混勻；和稀釋的Lipofectamine 2000，室溫放置20 min。將6孔板中的舊營養(yǎng)液吸出，用無血清培養(yǎng)基清洗2次。加入2 ml無血清配養(yǎng)基。直接將復合物加入到每孔中，搖動培養(yǎng)板，輕輕混勻。

1.2.3miRNA-30b納米轉(zhuǎn)染后TA-K細胞凋亡程度的檢測 使用Annexin V/PI法檢測TA-K細胞的凋亡程度，取2×106個細胞加入5 μl FITC-Annexin V及5 μl PI(濃度250 μg/ml)，混勻置冰浴暗處溫育10 min，PBS洗2遍，流式細胞儀分析；光源為488 nm氬離子激光器，F(xiàn)ITC受激發(fā)后發(fā)綠色熒光，PI發(fā)紅色熒光,每份標本收集10 000個細胞,然后在Macintosh650計算機上用相關(guān)軟件分析數(shù)據(jù)。

1.2.4miRNA-30b靶基因的預測、驗證及功能研究 在microRNA靶點預測數(shù)據(jù)庫(miR.org)中預測miRNA-30b的靶點，發(fā)現(xiàn)Survivin是miRNA-30 b潛在的生物學靶點；轉(zhuǎn)染miRNA-30 b納米粒收集RNA后，使用RT-PCR方法檢測survivin，上游引物為5-ggaccaccgcatctctacat-3、下游引物為3-tccagctccttgaagcagaa-5，反應程序設(shè)置為：預變性95 ℃ 10 min，95℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72℃ 60 s，30個循環(huán)，最后72℃ 10 min延伸；收集轉(zhuǎn)染miRNA-30b后的TA-K細胞，裂解并收集蛋白用Western-blot方法檢測Caspase-3的蛋白表達水平，步驟如下：SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜后加入人Caspase-3抗(按合適稀釋比例用0.01M PBS稀釋，液體必須覆蓋膜的全部)，4℃放置12 h以上后用PBS分別洗膜4次，每次5 min，后加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗(按合適稀釋比例用0.01 M PBS稀釋)，平穩(wěn)搖動，室溫2 hr，棄二抗，PBS分別洗膜4次，每次5 min，加入顯色液，進行顯色反應，在凝膠成像儀掃描成像；β-actin為對照組。

1.3統(tǒng)計學方法 對于轉(zhuǎn)染miRNA-30b及空白脂質(zhì)體后TA-K細胞凋亡比例及survivin的表達水平的分析，先用Shapiro-Wilk Test 及Levene' s Test判斷2組數(shù)據(jù)是否正態(tài)分布及方差是否齊性，滿足正態(tài)分布及方差齊性后采用均值±標準差進行表示子宮腫瘤的體積，并采用配對樣本t檢驗檢驗判斷兩者間差異是否具有統(tǒng)計學意義，否則使用非參秩合檢驗；以上所有統(tǒng)計過程均在SPSS18.0中完成，檢驗水準均為0.05。

2 結(jié)果

2.1miRNA-30b納米粒對于TA-K細胞凋亡的影響 在本研究中，我們轉(zhuǎn)染了不同濃度的miRNA-30b納米粒(50 nM、100 nM、200 nM)進入TA-K細胞中，通過Annexin V/PI法檢測2組中、凋亡細胞比例是否有統(tǒng)計學差異；正常細胞FITC及PI均低染，凋亡細胞FITC高染而PI低染，死亡細胞FITC及PI均高染，所以我們對FITC陽性、PI陰性的細胞進行流式分析統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，結(jié)果如表1所示，在轉(zhuǎn)染miRNA-30b納米粒后，TA-K細胞的凋亡比例顯著上調(diào)，并隨著轉(zhuǎn)染濃度的增加，TA-K細胞凋亡比例也隨之上調(diào)，說miRNA-30b能夠促進TA-K腫瘤細胞的凋亡。見表1。

表1 轉(zhuǎn)染miRNA-30b后TA-K細胞與對照組的凋亡比例比較

注：*為轉(zhuǎn)染miRNA-30b納米粒后與對照組比較，2組間凋亡細胞比均成正態(tài)分布、方差齊性，使用兩獨立樣本t檢驗。

2.2miRNA-30b靶點的預測與RT-PCR驗證 通過在miRNA.org靶點預測數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)，miRNA-30b與Survivin的3-UTR區(qū)可以特異性結(jié)合，而Survivin是細胞凋亡過程中的抑制凋亡因子，故推測miRNA-30b可能通過負向調(diào)控Survivin的表達促進TA-K細胞的凋亡；隨后，我們對miRNA-30b與Survivin的靶向關(guān)系進行了驗證，首先轉(zhuǎn)染不同濃度的miRNA-30b進入TA-K細胞后使用RT-PCR的方法檢驗Survivin的表達水平，如表2所示，轉(zhuǎn)染miRNA-30b后TA-K細胞的Survivin的表達水平顯著低于對照組，且隨著miRNA-30b濃度的增加，Survivin的表達也逐漸下降。見表2。

表2 轉(zhuǎn)染miRNA-30b后TA-K細胞與對照組的Survivin表達水平的比較

注：*為轉(zhuǎn)染miRNA-30b納米粒后與對照組比較，Survivin表達水平成正態(tài)分布、方差齊性，獨立樣本t檢驗。

2.3miRNA-30b靶點Survivin的western-blot驗證 miRNA與靶點之間的相互作用主要體現(xiàn)在蛋白水平上，所以蛋白水平的改變也是檢測兩者靶向關(guān)系的金標準；按上述方法，轉(zhuǎn)染miRNA-30b(200nM)進入TA-K細胞中，于72 h收集蛋白，進行western-blot檢測，如圖1所示，在轉(zhuǎn)染miRNA-30b納米粒后TA-K細胞中的survivin蛋白表達水平顯著下調(diào)，說明Survivin確實是miRNA-30b的生物學靶點。

Figure: the result of Western Blot圖1 Western blot結(jié)果

3 討論

甲狀腺未分化癌是甲狀腺中較為少見的惡性腫瘤，發(fā)病率較低，但惡性程度高、病死率高。甲狀腺未分癌通常病程發(fā)展迅猛，確診時已侵犯周圍的組織器官，如氣管、食管、血管、肌肉等，且有一半左右的患者在診斷時已有遠處轉(zhuǎn)移，此時即使給予積極的治療，僅少患者能夠長期生存，大部分患者在短時間內(nèi)死亡，一般從確認到死亡中位生存期僅4～8個月[3-4]。由于甲狀腺未分化癌手術(shù)、放療、化療療效均較差，所以探討甲狀腺未分化癌的具體發(fā)病機制以及探索新的治療策略對于甲狀腺未分化癌十分重要。

microRNA，是一類內(nèi)源性的短序列非編碼RNA，其主要功能是在轉(zhuǎn)錄后水平參與靶基因的調(diào)控，它幾乎參與機體所有的生物學活動，被認為是腫瘤表觀遺傳學中的重要一環(huán)；盡管近來隨著腫瘤生物學的發(fā)展，人們對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展的理解得到了不斷的加深，但是對于其具體的發(fā)病機制還不是十分清楚，當前仍缺少能被廣泛接受的、十分有效的腫瘤標記物用于甲狀腺未分化癌的診斷、治療以及預后判斷[5]；在甲狀腺未分化癌中存在許多異常表達的microRNA，這些microRNA參與了腫瘤的生長、分化、浸潤以及轉(zhuǎn)移等過程，而這些異常microRNA的發(fā)現(xiàn)為進一步研究該類腫瘤提供了新的思路，某些特異的microRNA也將成為腫瘤診療的新的策略。

本研究中，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了miRNA-30b納米粒后TA-K細胞的生物學特性發(fā)生改變，即TA-K細胞凋亡增加，且隨著納米粒的轉(zhuǎn)染濃度的增加，凋亡的比例也隨之增加；因此，本研究證實，miRNA-30b可以促進TA-K腫瘤細胞的凋亡；而對于miRNA-30b促進腫瘤細胞凋亡的具體機制，我們發(fā)現(xiàn)Survivin在該過程中發(fā)揮著重要作用，同樣在轉(zhuǎn)染miRNA-30b后，TA-K細胞內(nèi)的Survivin的表達水平顯著下調(diào)，隨后Western blot檢查證實在蛋白水平上miRNA-30b可以負向調(diào)控Survivin的表達；所以，miRNA-30b可以通過下調(diào)Survivin的表達促進TA-K細胞的凋亡。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成員，Survivin具有腫瘤特異性，只表達于腫瘤和胚胎組織，且與腫瘤細胞的分化增殖、浸潤轉(zhuǎn)移以及預后密切相關(guān)[6]，本研究中使用的miRNA-30b可以很好作用于TA-K細胞中Survivin分子，為臨床治療甲狀腺未分化癌提供了新的思路。此外，在當前的一些研究中，已經(jīng)證實miRNA-30b在其它腫瘤如食管癌、膠質(zhì)瘤中表達均顯著異常，在食管癌中研究發(fā)現(xiàn)miRNA-30b的表達水平顯著下調(diào)，說明在食管癌細胞中miRNA-30b表達低于正常組織，其促進腫瘤細胞凋亡的作用減弱可能是導致腫瘤生成的重要原因之一[7]；而在膠質(zhì)瘤中，研究發(fā)現(xiàn)miRNA-30b與Trail誘導的腫瘤細胞凋亡有關(guān)[8]，進而說miRNA-30b與腫瘤細胞凋亡密切相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)miRNA-30b可以通過作用Survivin促進TA-K細胞的凋亡，這一現(xiàn)象也為將來甲狀腺未分化癌的臨床治療提供了新的思路，而對于miRNA-30b在甲狀腺未分化癌中具體作用機制仍需要進一步闡明。

【 參 考 文 獻 】

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