趙海艷，王貝貝，李獻(xiàn)銳，任聚杰，籍雪平

(1.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北石家莊 050017；2.河北科技大學(xué)理學(xué)院，河北石家莊 050018)

基于還原氧化石墨烯/普魯士藍(lán)-殼聚糖納米復(fù)合物的高靈敏葡萄糖生物傳感器研究

趙海艷1，王貝貝1，李獻(xiàn)銳1，任聚杰2，籍雪平1

(1.河北醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北石家莊 050017；2.河北科技大學(xué)理學(xué)院，河北石家莊 050018)

在電沉積制備普魯士藍(lán)-殼聚糖(PB-CS)膜修飾金電極的基礎(chǔ)上，引入新型納米材料還原氧化石墨烯(RGO)，固定葡萄糖氧化酶(GOD)，構(gòu)建基于RGO/PB-CS納米復(fù)合材料的葡萄糖生物傳感器。結(jié)果表明，由于RGO獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)以及RGO與PB之間的協(xié)同作用，大大提高了此傳感器的工作性能。在0.0 V工作電位下，該傳感器具有較高的靈敏度(65.3 μA·(mmol/L)-1·cm-2)和較低的檢測限(6 μmol/L)。傳感器具有較小的表觀米氏常數(shù)(1.43 mmol/L)，表明該固定酶對葡萄糖具有較高的親和力。

還原氧化石墨烯；普魯士藍(lán)；殼聚糖；葡萄糖氧化酶；生物傳感器

石墨烯，僅有一個碳原子厚度，是由sp2雜化碳原子緊密堆積成的二維蜂窩狀晶格結(jié)構(gòu)，由于其無可比擬的優(yōu)良性能，在生物傳感器及電化學(xué)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[1-2]。還原氧化石墨烯(RGO)包含一些特征性官能團(tuán)，例如—OH和—COOH，這些官能團(tuán)有利于RGO和其他納米材料形成納米復(fù)合材料。

最近，越來越多的研究者致力于基于RGO納米復(fù)合材料的電化學(xué)生物傳感器研究[3]，RGO能夠與不同的納米材料產(chǎn)生協(xié)同作用，從而增強(qiáng)電化學(xué)催化活性，改善傳感器的靈敏度[4]。殼聚糖(CS)作為一種天然多糖，含有大量的—NH2和—OH官能團(tuán)，具有良好的成膜能力、生物兼容性和生物可降解性，對蛋白質(zhì)有良好的親和性，有利于保持酶的活性[5]。普魯士藍(lán)(PB)是一種典型的鐵氰化物，能夠在較低電位下選擇性電化學(xué)還原過氧化氫[6]。PB-RGO納米復(fù)合材料曾被用來構(gòu)建一種新型的電流型生物傳感器[6]，然而，PB在電極表面容易滲漏，且在中性和堿性溶液中不穩(wěn)定。為了克服這一缺陷，科研工作者將PB與一些高分子聚合物相結(jié)合，從而改善傳感器的工作性能[5,7]。但是傳統(tǒng)制備PB的方法操作復(fù)雜、耗時長，且PB納米粒子在較長時間下不穩(wěn)定。因此，有必要探索一種新方法，將PB和RGO有效結(jié)合形成穩(wěn)定的納米復(fù)合材料，用于電極修飾，以改善生物傳感器的穩(wěn)定性和靈敏度。

本研究中，將PB和CS同時電沉積到金電極表面，然后將RGO分散液滴加到PB-CS修飾的電極表面，形成PB-RGO納米復(fù)合物，為葡萄糖氧化酶(GOD)的吸附提供了較大的比表面積；同時由于PB-CS與RGO之間的協(xié)同作用，使得該生物傳感器具有較高的靈敏度。CS的引入，改善了傳統(tǒng)純PB膜修飾電極的不足，獲得了能在中性及弱堿性條件下使用的修飾電極，為酶的固定化創(chuàng)造一個適宜的微環(huán)境，提高了傳感器的穩(wěn)定性。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

CHI750 電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司提供)；79HW-1恒溫加熱磁力攪拌器(江蘇榮華儀器制造有限公司提供)；DV215CD精密電子天平(OHAUS 公司提供)；KQ2200DE超聲波清洗器(昆明超聲儀器有限公司提供)；冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡(S-4800，產(chǎn)地為日本)；T1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司提供)；X射線衍射儀(XRD，D/MAX-2500，產(chǎn)地為日本)。

葡萄糖氧化酶(GOD，Sigma公司提供)；石墨粉(光譜純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供)；葡萄糖(分析純，中國天津凱通化學(xué)試劑廠提供)；其他試劑均為分析純；實(shí)驗(yàn)用水為高純水。

1.2石墨烯的制備

采用Hummers and Offeman法[8]制備氧化石墨烯，通過文獻(xiàn)報道方法[9]將制備的氧化石墨烯還原成RGO。本實(shí)驗(yàn)通過紫外光譜掃描技術(shù)和X射線衍射對氧化石墨烯和石墨烯進(jìn)行表征，證明了石墨烯的成功制備。

1.3酶電極制備

依次用1.0，0.3和0.05 μm的Al2O3粉將金電極拋光成鏡面，用蒸餾水超聲清洗。隨后把電極依次置于丙酮、Piranha 溶液 (V(H2SO4) ∶V(H2O2)=3∶1) 中超聲。用水清洗后，晾干。將處理干凈的金電極置于0.5 mmol/L K3[Fe(CN)6]+0.5 mmol/L FeCl3+體積分?jǐn)?shù)為0.01%的 CS(含0.1 mol/L KCl+0.01 mol/L HCl)的混合溶液中，以20 mV/s的掃速在電位范圍-0.1～0.45 V內(nèi)循環(huán)伏安掃描10圈，室溫下晾干。然后在電極表面滴加5 μL上述制備的RGO分散液，室溫晾干后再滴加5 μL質(zhì)量濃度為10 mg/mL的 GOD，于4 ℃晾干，滴加5 μL CS溶液，用 0.25%(體積分?jǐn)?shù))戊二醛交聯(lián)20 min。然后用水清洗，得到CS/GOD/RGO/PB-CS/Au。

1.4檢測方法

采用三電極系統(tǒng)檢測：工作電極為修飾電極，參比電極為Ag/AgCl(3 mol/L KCl)，對電極為鉑絲。在室溫下，采用循環(huán)伏安法(CV)對電極的修飾過程進(jìn)行表征，并采用電流-時間(I-t)曲線法研究傳感器對葡萄糖的電流響應(yīng)。

2 結(jié)果與討論

2.1掃描電鏡

首先采用掃描電鏡(SEM)對PB-CS和RGO/PB-CS修飾電極進(jìn)行表征。圖1 a)為PB-CS的SEM圖像?？梢钥吹剑琍B是納米立方體結(jié)構(gòu)，平均邊長為50 nm，PB-CS均勻分布在電極表面；從圖1 b)可知，當(dāng)RGO滴加到PB-CS修飾電極上后，能看到多層褶皺式的RGO薄膜[10]完全覆蓋在PB-CS表面[11]。由此表明RGO和PB-CS已經(jīng)修飾到電極表面。

圖1 不同修飾電極的SEM圖像Fig.1 Scanning electron microscopy (SEM) images of different modified electrodes

2.2電極修飾過程表征

實(shí)驗(yàn)采用CV對電極表面進(jìn)行表征。修飾電極在0.1 mol/L PBS溶液(含0.1 mol/L KCl，pH值為6.5)中的CV如圖2所示。同裸金電極(見圖2 a)相比，電沉積PB-CS(見圖2 b)后，出現(xiàn)一對明顯的氧化還原峰，這與普魯士藍(lán)和普魯士白的相互轉(zhuǎn)化相對應(yīng)[12]。當(dāng)在PB-CS/Au上修飾RGO后(見圖2 c)，與PB-CS/Au(見圖2 b)相比，峰電流明顯增大，表明RGO大大改善了傳感器的導(dǎo)電性和電子轉(zhuǎn)移過程。當(dāng)進(jìn)一步修飾上GOD后(見圖2 d)，峰電流顯著下降，說明GOD作為一種非導(dǎo)電物質(zhì)，阻礙了電子傳遞，電流響應(yīng)明顯減少。再修飾上CS后(見圖2 e)，峰電流又有所增加，這可能是由于CS具有微弱的導(dǎo)電性。以上結(jié)果表明PB，RGO，GOD和CS成功組裝到金電極上。

圖2 不同修飾電極在0.1 mol/L PBS的循環(huán)伏安圖 Fig.2 CVs of different modified electrodes in 0.1 mol/L PBS

2.3RGO對傳感器電流響應(yīng)的影響

實(shí)驗(yàn)考察了RGO對生物傳感器電流響應(yīng)的影響。采用2支不同的修飾電極CS/GOD/PB-CS/Au和CS/GOD/RGO/PB-CS/Au，在PBS(0.1 mol/L，pH值為6.5)和含有10 mmol/L葡萄糖的PBS溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安測定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不加RGO的修飾電極在加入葡萄糖前后的電流變化值為1.96 μA，與之相比，CS/GOD/RGO/PB-CS修飾電極對葡萄糖的電流響應(yīng)值為4.35 μA。結(jié)果表明，RGO的加入顯著提高了傳感器對葡萄糖的電化學(xué)響應(yīng)，這歸結(jié)于RGO獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)[1]和RGO與PB-CS間的協(xié)同作用。

2.4傳感器對葡萄糖的電流響應(yīng)

圖3為CS/GOD/RGO/PB-CS修飾電極在含有不同濃度的葡萄糖溶液中的CV圖。由圖3可以看出，與未加葡萄糖的CV圖(見圖3 a)相比，在加入1.0 mmol/L葡萄糖后(見圖3 b)，還原峰電流增加，并且隨著葡萄糖濃度的增加(見圖3 c和圖3 d)，還原峰電流進(jìn)一步增大，這是由于葡萄糖的加入在CS/GOD/RGO/PB-CS修飾電極表面發(fā)生的生物電催化反應(yīng)所致。圖3的內(nèi)插圖展示了還原峰電流值與葡萄糖濃度之間的關(guān)系。

本實(shí)驗(yàn)還考察了在0.0 V工作電位下，該生物傳感器對葡萄糖的電流響應(yīng)，結(jié)果如圖4所示。加入葡萄糖溶液后，還原電流快速增加，在5 s內(nèi)達(dá)到穩(wěn)態(tài)電流的95%，表明傳感器對葡萄糖響應(yīng)迅速。葡萄糖濃度在0.01～1.05 mmol/L范圍內(nèi)，響應(yīng)電流與葡萄糖濃度呈線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 9，檢測限為6 μmol/L，由標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率計(jì)算得到的靈敏度為65.3 μA·(mmol/L)-1·cm-2，與其他文獻(xiàn)報道的基于石墨烯的葡萄糖傳感器相比[13-14]，靈敏度得到了顯著改善。計(jì)算求得米氏常數(shù)為1.43 mmol/L，比天然GOD[15]以及

圖3 CS/GOD/RGO/PB-CS/Au電極對葡萄糖響應(yīng)的循環(huán)伏安圖(內(nèi)插圖為還原峰電流值與葡萄糖濃度之間的關(guān)系) Fig.3 CVs of the CS/GOD/RGO/PB-CS/Au electrode for different concentrations of glucose(Inset,the changes of the reduction peak current with the increase of the glucose concentration)

圖4 CS/GOD/RGO/PB-CS/Au電極對葡萄糖響應(yīng)的電流-時間曲線(內(nèi)插圖為葡萄糖響應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線)Fig.4 Current-time curves of the CS/GOD/RGO/PB-CS/Au electrode for glucose (Inset,standard response curve of glucose)

最近報道的葡萄糖傳感器的值[13-14]都要小。較小的米氏常數(shù)表明該修飾膜固定的酶與底物的親和力比較大，顯示了較高的催化活性。

2.5傳感器的選擇性、重現(xiàn)性、重復(fù)性和穩(wěn)定性

本實(shí)驗(yàn)中采用I-t曲線法考察了該傳感器的選擇性。依次在底液中加入葡萄糖、尿酸、抗壞血酸、對乙酰氨基酚、L-酪氨酸和L-半胱氨酸。結(jié)果顯示，加入葡萄糖之后，響應(yīng)電流迅速增加，而加入尿酸、抗壞血酸、對乙酰氨基酚、L-酪氨酸和L-半胱氨酸后，響應(yīng)電流變化很小，可以忽略不計(jì)。結(jié)果表明該酶電極在低電位(0.0 V)對葡萄糖具有很好的選擇性。這主要是由于覆蓋在酶膜外層的CS在電極表面交聯(lián)成致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，可以阻止電活性干擾物質(zhì)的滲入，但不妨礙H2O2的自由通過，因此提高了傳感器的選擇性[16]。實(shí)驗(yàn)中制作3支CS/GOD/RGO/PB-CS修飾電極，對0.1 mmol/L葡萄糖分別進(jìn)行檢測，考察了傳感器的重現(xiàn)性，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為6.3%。同時也考察了該傳感器的重復(fù)性，用同一支電極連續(xù)6次檢測0.1 mmol/L葡萄糖，得到的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.2%。結(jié)果表明該傳感器具有良好的重現(xiàn)性和重復(fù)性。將已修飾好的電極置于0.1 mol/L PBS中，于4 ℃儲存?zhèn)溆?，對其穩(wěn)定性進(jìn)行考察。結(jié)果表明，13 d后，該生物傳感器對0.5 mmol/L葡萄糖的電流響應(yīng)僅降低了5%，表明此傳感器具有良好的穩(wěn)定性。

2.6血清標(biāo)本中葡萄糖檢測

本實(shí)驗(yàn)還考察了該生物傳感器在實(shí)際樣品中的應(yīng)用，為了驗(yàn)證傳感器在實(shí)際樣品中對葡萄糖的響應(yīng)，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，將構(gòu)建的傳感器用于檢測糖尿病人血糖濃度。由表1可以看出，通過本方法檢測葡萄糖獲得的回收率為93.9%～100.0%，表明該方法檢測葡萄糖具有較高的準(zhǔn)確性。

表1 糖尿病人血清中葡萄糖測定結(jié)果Tab.1 Results of glucose testing in serum of diabetic patients

注：*為平均值，N=3。

3 結(jié) 語

通過將GOD固定在RGO/PB-CS修飾的金電極表面，成功構(gòu)建了一種高靈敏度的葡萄糖生物傳感器。將RGO與PB-CS相結(jié)合，有效促進(jìn)了電極表面與分析底物之間的電子轉(zhuǎn)移，并且改善了該傳感器的工作性能。此外，RGO和CS也有助于增加GOD在電極表面的吸附量，為GOD的固定提供一個適宜的微環(huán)境。同時該傳感器用于糖尿病人血糖的快速測定，取得了滿意的效果，具有潛在的應(yīng)用價值。

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Study of high sensitive glucose biosensor based on reduced graphene oxide/Prussian blue-chitosan nanocomposite

ZHAO Haiyan1, WANG Beibei1, LI Xianrui1, REN Jujie2, JI Xueping1

(1. Basic Medical College, Hebei Medical University, Shijiazhuang Hebei 050017, China; 2. School of Science, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang Hebei 050018, China)

With Prussian blue (PB)-chitosan (CS) nanocomposite directly electrodeposited on Au electrode, combined with reduced graphene oxide (RGO) and immobilized glucose oxidase (GOD), a RGO/PB-CS nanocomposite based glucose biosensor is constructed. The results show that due to the superb physicochemical property of RGO and the synergistic effect between RGO and PB-CS nanocomposite, the electrochemical response of the biosensor to glucose is obviously improved. The biosensor shows a high sensitivity of 65.3 μA·(mmol/L)-1·cm-2and a low detection limit of 6 μmol/L. The apparent Michaelis-Menten constant of enzymatic reaction is 1.43 mmol/L, showing high affinity of the immobilized GOD and glucose.

reduced graphene oxide; Prussian blue; chitosan; glucose oxidase; biosensor

2014-03-07；

2014-04-10；責(zé)任編輯：張士瑩

河北省教育廳科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(ZH2012078)

趙海艷(1988-)，女，河北廊坊人，碩士研究生，主要從事電化學(xué)分析方面的研究。

籍雪平教授。E-mail:xuepingji@126.com

1008-1542(2014)03-0237-05

10.7535/hbkd.2014yx03005

O175.8

A

趙海艷，王貝貝，李獻(xiàn)銳，等.基于還原氧化石墨烯/普魯士藍(lán)-殼聚糖納米復(fù)合物的高靈敏葡萄糖生物傳感器研究[J].河北科技大學(xué)學(xué)報,2014,35(3):237-241. ZHAO Haiyan, WANG Beibei, LI Xianrui, et al.High sensitive glucose biosensor based on reduced graphene oxide/Prussian blue-chitosan nanocomposite[J].Journal of Hebei University of Science and Technology,2014,35(3):237-241.