柴明艷

摘要：采用羧甲基纖維素鈉（CMC）-剛果紅平板法，對富含腐爛玉米秸稈的土樣進行纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選及目標菌株發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化試驗。結(jié)果表明，篩選分離出10株產(chǎn)纖維素酶菌株，其中有3株菌株產(chǎn)酶效果較好，特別是菌株tg31對玉米秸稈水解率高達37.62%，其最佳發(fā)酵工藝的溫度為28 ℃，發(fā)酵初始pH 5.0，接種量6%，搖瓶轉(zhuǎn)速180 r/min，經(jīng)5 L罐放大試驗，得出在120 h時其濾紙酶活力（FPA）可達到14.21 IU/mL。

關(guān)鍵詞：纖維素酶；菌株；發(fā)酵；玉米秸稈；水解

中圖分類號：Q939.96 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）13-3141-04

Optimizing Conditions of Screening and Fermentation for a Strain of High-yield Cellulase

CHAI Ming-yan

（Pharmaceutical and Biological Engineering Department of Zibo Vocational Institute， Zibo 255314， Shandong， China）

Abstract： To obtain the high-yield cellulase strain， the sodium carboxymethyl cellulose （CMC）-congored plate method was used to screen cellulase-producing bacteria in soil samples riched with corn stalk fiber. Fermentation conditions were optimized also determined. The results showed that 10 cellulase-producing bacterial strains were isolated. Among these strains， three bacterial strains had the best effects on producing the celluloses. Especially， the strain tg31 could hydrolyze corn straw at a rate up to 37.62%. The optimal fermentation conditions were temperature of 28 ℃， initial fermentation with pH 5.0， 6% inoculation and shaking speed of 180 r/min. Under the optimal condition， the strain was amplified with 5 L tank and enzyme activity reached 14.21 IU/mL at 120 h. The strain Tg31 obtained the best FPA activity with significant hydrolysis rate of corn stalk， indicating that it had the abroad prospect of application.

Key words： cellulase； strain； fermentation； corn stalk； hydrolysis

中國是農(nóng)業(yè)大國，每年產(chǎn)生的農(nóng)作物秸稈總量超過7億t，約占世界秸稈總產(chǎn)量的1/3[1，2]，其中玉米秸稈產(chǎn)量高達2.2億t[3]。玉米秸稈的主要成分是纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等，難以被人類有效利用。目前，中國玉米秸稈大部分被直接焚燒，不僅對環(huán)境造成了極大的污染，同時也浪費了大量的秸稈纖維素資源[4]。為改變現(xiàn)狀，開發(fā)纖維素酶降解玉米秸稈，實現(xiàn)廢棄資源的生物利用，已逐漸成為該領(lǐng)域的研究熱點之一。纖維素酶可充分降解秸稈中的纖維素，將其轉(zhuǎn)化為微生物可利用的糖類，大大提高玉米秸稈的經(jīng)濟利用價值，該技術(shù)在醫(yī)藥中間體、精細化工、食品、飼料及生物能源等領(lǐng)域都有廣泛的應用前景[5，6]。因此，展開高產(chǎn)纖維素酶菌株的選育、發(fā)酵工藝條件優(yōu)化等研究工作，對纖維素的商業(yè)化開發(fā)具有重大意義。

本研究在玉米秸稈地進行針對性的取樣篩選，獲得一株高產(chǎn)、高玉米秸稈水解率的菌株，并對其產(chǎn)酶條件進行了搖瓶優(yōu)化及5 L罐發(fā)酵工藝放大，為玉米秸稈纖維素資源的產(chǎn)業(yè)化應用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 從遼寧省喀左縣富含腐爛玉米秸稈地區(qū)取土樣若干。

1.1.2 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）的配制參照邱雁臨等[7]的配方。初篩培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）2.0 g，瓊脂2.2 g，土豆汁20 g，蔗糖2.0 g，去離子水 100 mL；復篩培養(yǎng)基：CMC-Na 2.0 g，瓊脂2.2 g，土豆汁20 g，蔗糖2.0 g，剛果紅0.02%，去離子水100 mL；發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨1.0 g，酵母粉1.0 g，CMC-Na 1.0 g，NaCl 0.5 g，KH2PO4 0.1 g，去離子水100 mL，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 菌株 初篩：參照肖舸等[8]的方法稍加改動，稱取0.5 g 樣品加入49.5 mL含有玻璃珠的生理鹽水中（稀釋度為10-2），振蕩30 min混勻，并將上清液按10-3、10-4、10-5稀釋，各取1 mL稀釋液接種于分離培養(yǎng)基平板上，每個稀釋度進行兩次重復，28 ℃培養(yǎng)48 h，挑取生長較快的菌株純化兩次，鏡檢后接種到斜面上，4 ℃保存。復篩：使用打孔器將純化后的菌株挑取單菌落放置到CMC-剛果紅平板上，28 ℃培養(yǎng)3 d，測量透明圈的大小，透明圈大說明纖維素酶的分泌能力強[9]。

1.2.2 搖瓶發(fā)酵優(yōu)化 研究搖瓶發(fā)酵溫度、pH、接種量及轉(zhuǎn)速對菌株產(chǎn)酶效果的影響，以期獲得最適的產(chǎn)酶工藝。用250 mL三角瓶將篩選得到的水解圈較大的菌株接種于30 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)。其中，溫度設(shè)計：24、26、28、30、32 ℃；初始pH設(shè)計：3、4、5、6、7、8；接種量設(shè)計：2%、4%、6%、8%、10%；搖瓶轉(zhuǎn)速設(shè)計：120、150、180、210、240 r/min。發(fā)酵5 d后取樣測酶活性，每個研究條件均設(shè)置2個平行樣。

1.2.3 濾紙（FPA）酶活測定 依據(jù)劉德海等[10]的研究，將發(fā)酵液5 000 r/min離心10 min，收集上清液，將0.5 mL發(fā)酵液上清液和1 mL 0.05 mol/L pH 4.8檸檬酸緩沖液加入試管，加熱至50 ℃，加入whatman濾紙[（50±1 mg）]，反應60 min，立即加入3，5-二硝基水楊酸（DNS）反應液3 mL，水浴5 min。冷卻至室溫，用去離子水適當稀釋，在540 nm處測定吸光度。濾紙酶活定義為每分鐘轉(zhuǎn)化生產(chǎn)1 μmol葡萄糖所需的酶量為1 IU。

1.2.4 水解試驗 參照文獻[11]，采用酶液進行水解試驗，水解體系為30 mL，反應溫度為50 ℃，底物濃度10%，pH 4.8的檸檬酸緩沖液為緩沖體系，酶的裝載量根據(jù)底物量定為10 IU/g。分別對玉米芯、玉米秸稈、木屑、蔗糖渣與棉子殼進行水解試驗。

1.2.5 5 L發(fā)酵罐放大 將搖瓶獲得的最佳發(fā)酵工藝條件進行5 L發(fā)酵罐放大試驗，發(fā)酵開始24 h第一次取樣，以后每隔12 h進行一次取樣，共發(fā)酵120 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)纖維素酶菌株的分離篩選

采用剛果紅染色法從富含腐爛玉米秸稈的土樣中篩選獲得菌圈較大的10株菌株，菌株編號及透明菌圈直徑如表1所示。jx25、lt01及tg31產(chǎn)纖維素酶能力最強，選取此3株菌株進行發(fā)酵工藝優(yōu)化試驗。

2.2 搖瓶發(fā)酵結(jié)果

2.2.1 最佳溫度 試驗考察不同溫度水平對3株菌株搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶效果的影響，經(jīng)發(fā)酵液測得FPA酶活。由圖1可見，jx25與tg31最適發(fā)酵溫度均為28 ℃，lt01最適溫度為30 ℃。其中tg31菌株酶活最高為5.89 IU/mL，其次jx 25酶活為4.72 IU/mL，lt 01酶活僅為4.42 IU/mL。

2.2.2 最適初始pH 由圖2可見，隨著初始pH的增加jx25、lt01和tg31產(chǎn)酶能力逐漸提高，在pH 5.0時均達到最高，分別為6.234、6.824與7.350 IU/mL，而后酶活隨pH增加逐漸降低，當pH 為8.0時酶活最低。由此可見，選用初始pH 5.0作為3株菌株搖瓶發(fā)酵pH最為適宜。

2.2.3 最適接種量 由圖3可見，接種量為6%時，3株菌株的FPA酶活均達到最高，其中tg31酶活最高，達到9.56 IU/mL，是jx25酶活（7.92 IU/mL）的1.2倍。故菌株最適接種量為6%。

2.2.4 最佳搖瓶轉(zhuǎn)速 由圖4可見，隨著轉(zhuǎn)速的提高，初始階段酶活也隨之提高，當轉(zhuǎn)速為180 r/min時，3株菌株酶活均達到最高，jx25、lt01、tg31分別為9.83、10.49、13.68 IU/mL，而后隨著轉(zhuǎn)速增加酶活降低。可見，最佳搖瓶轉(zhuǎn)速為180 r/min。

2.3 纖維素酶對不同底物的水解

3株菌株發(fā)酵獲得的發(fā)酵液對不同底物的水解效率如圖5所示。由圖5可見，jx25對甘蔗渣和木屑的水解效率最高，分別達到18.23%和27.46%；水解底物為棉子殼、玉米秸稈、玉米芯時，tg31水解效率最好，分別為27.38%、37.62%、27.86%。由此可知tg31是能產(chǎn)生針對玉米類秸稈纖維素高效高產(chǎn)降解酶的菌株，鑒于中國廢棄玉米秸稈量巨大的現(xiàn)狀，tg31具有廣闊的應用前景。

2.4 5 L發(fā)酵罐放大

綜合搖瓶發(fā)酵結(jié)果，tg31菌株FPA酶活最高，水解試驗得知其對玉米秸稈的水解效果最好，是一株能產(chǎn)生針對玉米類秸稈纖維素高效高產(chǎn)降解酶的菌株，故選擇tg 31進行5 L發(fā)酵罐放大。5 L發(fā)酵罐不同時間酶活曲線如圖6所示。由圖6可見，5 L發(fā)酵罐中，接種后酶活迅速提高，發(fā)酵前96 h提升速率較快，96～120 h時酶活提升速率減緩，120 h時酶活最高，達到14.2 IU/mL。

3 小結(jié)和討論

運用透明圈法和搖瓶液體培養(yǎng)法，對從富含腐爛玉米秸稈的土壤樣品中得到的纖維素酶高產(chǎn)菌進行初篩和復篩，獲得一株高酶活、高產(chǎn)纖維素酶的菌株tg31，將其作為液體發(fā)酵條件研究的供試菌種。對該菌的產(chǎn)酶條件（包括最適溫度、最適pH、最適接種量和最佳轉(zhuǎn)速）進行研究得出搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶最優(yōu)工藝條件為發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵初始pH 5.0，最適接種量6%，最佳轉(zhuǎn)速180 r/min，此時酶活達到13.68 IU/mL，對玉米秸稈水解率達到37.62%，并可將此工藝成功放大應用于5 L發(fā)酵罐中。

纖維素作為世界上最豐富的可再生資源，其生物利用潛力備受人們的關(guān)注。據(jù)研究得出，酶學降解產(chǎn)生單糖或蛋白質(zhì)等產(chǎn)品是纖維素生物利用的最佳途徑，其有關(guān)研究已成為生物科學的熱點領(lǐng)域。目前，隨著科學研究的不斷深入，纖維素酶的應用技術(shù)逐漸成熟。玉米秸稈作為豐富的可再生資源，含有大量纖維素和半纖維素成分，難以被生物有效降解。經(jīng)過纖維素酶等酶系的有效降解，能夠產(chǎn)生更高的經(jīng)濟價值。為此，利用纖維素酶降解玉米秸稈的研究具有重要的科學意義。

目前，有關(guān)纖維素酶及其產(chǎn)酶菌的研究已有大量報道，并取得了一定的進展，主要集中在以下幾個方面：一是產(chǎn)纖維素酶微生物的篩選。已知自然界中能分解纖維素的微生物主要為真菌及部分細菌，其中以木霉、青霉及曲霉的降解能力最為突出[12，13]；二是影響纖維素酶菌株在發(fā)酵罐中放大培養(yǎng)的因素，如溶氧[14]、傳質(zhì)[15]及起泡沫[16]等；三是產(chǎn)纖維素酶菌株的發(fā)酵方式，如補料及分批發(fā)酵[17]等。

本研究從富含腐爛玉米秸稈的土樣中獲得高產(chǎn)纖維素酶菌株tg31，依據(jù)發(fā)酵條件優(yōu)化的初步結(jié)果發(fā)現(xiàn)，tg31具有良好的產(chǎn)纖維素酶特性，具有廣闊的應用前景。結(jié)合國內(nèi)外研究進展，有關(guān)tg31的后續(xù)研究，應著重考慮結(jié)合流體力學及數(shù)學模型進行有效的發(fā)酵工藝優(yōu)化。

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