朱小寶 田小林 宋永攀 龐凌坤

(桂林醫(yī)學院 廣西桂林 541001)

結直腸癌的發(fā)生與發(fā)展涉及多基因、多途徑的改變。篩選特異敏感的分子指標用于結直腸癌的人群篩查，將對早期診斷和治療結直腸癌，降低結直腸癌罹患及減少患者死亡、延長生存時間均有重要意義。隨著對人類基因組不斷深入的研究,生物性致癌因子尤其是病毒性致癌因子在誘導人類腫瘤發(fā)生與發(fā)展過程中起到激活作用。近年諸多家研究證實,JCV與人類腫瘤如腦腫瘤、胃癌、食管癌、肺癌、前列腺癌中均已證實上述結論[1～3]。但對于JCV在結腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用仍沒有統(tǒng)一的認識。有研究報道人體細胞是JCV的半容許性細胞,即JCV存在于人結直腸腺癌組織中,但是否具有致癌性及其機理國外已有相關報道,國內罕有JCV在結直腸腺癌中表達及相關性深入的研究。β-catenin與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉移及患者預后不良關系密切。胃癌、肝癌、胰腺癌、膀胱癌、前列腺癌和乳腺癌等癌癥中均已證實上述結論[4～6]，即Wnt/β-catenin正常表達的罹癌患者，其預后要優(yōu)于那些Wnt/β-catenin表達上調的病人。這就提示W(wǎng)nt/β-catenin 表達可作患者預后預測的生物標志物和早期診斷的重要候選生物分子指標。本研究通過免疫組織化學及RT-PCR技術，結直腸腺癌組織JCV早期基因編碼產(chǎn)物大T抗原(T-Ag)與β-catenin在人結直腸腺癌組織中的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標本 收集筆者所在單位2010年5月至2011年8月期間經(jīng)外科手術切除的結直腸腺癌(Colorectal carcinoma,CRC)組織標本65例, 其中男42例，女23例，患者術前未做過化療和放療；20例結直腸非腫瘤標本多為腸梗阻標本，所有標本均由兩位以上病理醫(yī)師確診。按病理組織學分級，其中高分化17例，中分化12例，低分化36例。按TNM分期，Ⅰ期6例，Ⅱ期11例，Ⅲ期39例，Ⅳ期9例。非癌患者為腸梗阻正常腸黏膜20例為正常對照。

1.1.2 試劑 鼠抗人單克隆抗體SV40 T-Ag及β-catenin購自美國Sant Cruz公司,檸檬酸抗原修復液、S-p越敏免疫組化染色試劑盒均購自福州邁新生物技術開發(fā)有限公司。PCR引物，由Invitrogen英濰捷基(上海)貿易有限公司合成；Trizol(美國Invitrogen 公司)；逆轉錄試劑盒，美國Fermentas公司，PCR試劑盒，北京天澤基因科技有限公司。

1.2 免疫組織化 S-P法操作嚴格按照試劑盒說明進行。石蠟切片脫蠟、脫水、 檸檬酸高壓熱修復,滴加一抗4℃過夜。順次滴加試劑1及試劑2在37℃孵育10min。染色步驟按說明書進行。蘇木素輕度復染。二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡觀察。以已知標準陽性切片作為陽性對照。結果判定標準參照ENAM[6]報道的方法。JCV T-Ag以細胞核呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性(圖1)，按陽性細胞所占百分比評分(陽性細胞數(shù)的計算標準：觀察400個腫瘤細胞。陽性細胞數(shù)/400×100%來計算)：1%～10% 為(-)，>10%～90%為(+)。β-catenin以細胞膜呈現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性(圖2)。其中只有細胞膜β-catenin染色標記(++) 為正常表達;如細胞膜沒有表達或小于30%細胞數(shù)，標記(+) / (-) 判斷為表達減弱或表達喪失,即異常表達。(見圖3、圖4)

圖1 免疫組化 HP10*10

圖2 免疫組化 P10*10

圖3 JCV T-Ag在結直腸腺癌中的表達(*200)

圖4 β-catenin在非腫瘤結腸中的表達(*200)

1.3 定量RT-PCR檢測 取標本組織約100 mg，置于研磨缽中加液氮研磨。用TRIzoI(美國Inviirogen公司)法提取總RNA，用DNA合成試劑盒(美國Fermentas公司)反轉錄合成DNA。分別擴增β-catenin和JCV。β-catenin PCR反應條件：94℃預變性10 min， 94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)；JCV PCR反應條件：95℃預變性15 min， 95℃變性45 s，64℃退火45 s，72℃延伸45 s，共40個循環(huán)；PCR產(chǎn)物采用2%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

總體積為20 μL

2×Taq PCR Master Mix(μL)10rTaq酶(μL)0.15上游引物(μL)1下游引物(μL)1反轉錄反應液(μL)3ddH2O(μL)4.85

引物序列：

JCV上游引物 5'- ATGTATTCCACCAGGATTCCCATTCATC-3' 下游引物 5'- AGTTCTTGGAGACACCCCCTACAG-3'合成產(chǎn)物長度為154 bpβ-catenin上游引物 5'- TGAGGACAAGCCACAAGATTAC-3'下游引物 5'- TCCACCAGAGTGAAAAGAACG-3'合成產(chǎn)物長度為180 bp

2 結 果

2.1 結直腸癌組織與正常組織JCV T-Ag、β-catenin在結直腸腺癌、正常腸黏膜中的表達情況(免疫組化數(shù)據(jù)已經(jīng)發(fā)表) PCR結果現(xiàn)示：65例結直腸癌標本中JCV T-Ag陽性表達35例，陽性率為66.15%(43/65)；β-catenin蛋白陽性表達率為63.07%(41/65)；而癌旁正常組織標本中JCV幾乎不表達，癌組織表達水平明顯升高，有統(tǒng)計學意義(見表1)

表1 JCV T-Ag、β-catenin表達與結直腸腺癌病理參數(shù)之間的關系

3 討 論

JCV屬多瘤病毒屬多瘤病毒科病毒，主要包括JCV、BKV、SV40三種病毒，人群對其普遍易感，血清總成陽性率約為81%、35%、5%。感染后一般無臨床癥狀，但可以潛伏于腎臟和泌尿道上皮細胞及B淋巴細胞中[7]，它繁殖到一定的量時通過尿液排出體外。有研究證明[8]，JCV通過與細胞表面表達的α-2,6-連接唾液酸附著，與細胞表面表達的5-羥色胺2α亞型受體結合后才能對人類細胞進行感染，通過細胞膜表面含唾液酸殘基的糖蛋白受體結合，以包涵體依賴的方式進入細胞，并通過微絲、微管、中間纖維等細胞骨架蛋白轉運至細胞核。T-抗原是JCV感染早期基因表達的蛋白，它在致癌作用上有著明顯的差異。T-抗原具有多功能的磷酸蛋白，主要存在于核中，該抗原被認為是調節(jié)JC病毒的致癌重要因素[9]。Boltin研究[10]通過實時PCR測定JC病毒T-抗原，結果顯示其在結腸癌和腺瘤中的含量比對照組或正常結腸黏膜高。JC病毒T-抗原通過p53和pRb(視網(wǎng)膜母細胞瘤敏感性蛋白)結合，進一步介導DNA復制促進細胞轉化，因而T-抗原被認為在JC病毒致癌中起著重要的作用。T -抗原是非磷酸化蛋白，存在于感染細胞核及細胞質中，對細胞的轉化并非必須，但可起加強作用。T-Ag與pRb(視網(wǎng)膜母細胞瘤敏感性蛋白)結合置換了E2F，從而促進了細胞周期的進程和致癌轉換細胞不增殖的特點。從pRb上釋放的E2F通常刺激了p14ARF的表達，p14ARF能導致p53的穩(wěn)定性。T-Ag可直接鑲嵌到β-catenin上，并引起其堆積，因此該蛋白改變其位置到核上并在核內增強原癌基因(c-myc)和細胞周期調節(jié)蛋白D的表達，是典型的反Wnt信號路徑[11]。

Wnt信號在多種腫瘤的生長、轉移中具有重要作用，β-catenin蛋白是Wnt信號通路中的核心蛋白，當Wnt信號通路被激活后，該蛋白在細胞質持續(xù)增加，并向細胞核內轉移，與核內轉錄因子TCF/LEFs結合，從而激活多種基因的表達，導致細胞異常增殖[12]。β-catenin的主要功能之一是通過和E-cadherin結合成E-cadherin/catenins復合體來維持細胞結構的完整性和細胞之間的粘附作用。各種因素導致β-catenin的結構破壞時將導致其降解發(fā)生障礙，在細胞內的含量增加引起E-cadherin/catenins復合體的功能障礙，使細胞的完整性和粘附功能受到破壞，從而引起腫瘤細胞的轉移。Wnt通路受多種細胞外信號調節(jié)，分泌型卷曲相關蛋白和Wnt抑制因子(wIF)可直接抑制Wnt配體與受體結合從而抑制Wnt信號通路，DKK家族可通過結合LRPSl6抑制Wnt信號傳導。在正常情況下Wnt信號處于失活狀態(tài)，一旦Wnt通道被激活將會引起β-catenin在細胞質和胞核內異常表達使下游的基因出現(xiàn)異常，最終引起腫瘤的發(fā)生[13]。

本研究旨在通過RT-PCR技術來觀察JCV及β-catenin在結直腸癌標本中的表達情況，統(tǒng)計學結果顯示：①JCV在結直腸癌中表達顯著升高，而正常組織中表達無統(tǒng)計學意義。研究發(fā)現(xiàn)，57%～83%來源于膠質細胞的腫瘤和約50%的小兒髓母細胞瘤中存在JCV DNA和T抗原的表達[14]。我們可以從本次實驗結果再次證明JCV與結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關系，并在結直腸癌的演變過程中發(fā)揮著重要的作用。但是不同年齡、不同部位腫瘤及不同程度的表達差異均無統(tǒng)計學意義。②β-catenin在結直腸癌中表達顯著高于正常組織，低分化結直腸癌中明顯高于高分化腺癌，同時淋巴結轉移表達高于無淋巴結轉移的結直腸癌(P<0.05)。綜上所述，我們可以推測：JCV的表達可能與結直腸癌的生物學特性有關，在結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，通過檢JCV的表達，可為結直腸癌的診斷提供一定的依據(jù)。β-catenin異常表達可能是結直腸癌中E-鈣蛋白/連還蛋白復合體功能異常的結果，從而導致結直腸癌獲得較強的侵襲能力，極易擴散和轉移。通過檢測β-catenin為今后臨床防治結直腸癌的診斷、復發(fā)提供依據(jù)。

參 考 文 獻

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