耿志杰，林松柏，陳 軍，許少波，劉群峰，張澤榮，張 錦

1.廣東省醫(yī)療器械研究所 國(guó)家醫(yī)療保健器具工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510500；2. 華僑大學(xué)，福建 廈門 361021；3.黎明大學(xué)，福建 泉州 362000

α-淀粉酶用于水解淀粉，切斷α-1,4葡萄糖苷鍵產(chǎn)生麥芽糖、葡萄糖、寡糖和糊精等，作為一種重要的生物催化劑，具有高效、專一，反應(yīng)條件溫和的優(yōu)良特性，廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥、食品加工、啤酒釀造、石油化工等領(lǐng)域[1-3].但游離酶對(duì)外界環(huán)境(有機(jī)溶劑、酸堿、熱等)極其敏感，易失活變性，并且在工業(yè)生產(chǎn)中游離酶混入產(chǎn)品后，分離、純化困難，難以回收重復(fù)利用.由于游離酶存在這些缺陷，限制了其在工業(yè)生產(chǎn)中的廣泛應(yīng)用[4-5].選用合適的載體材料，采用物理或化學(xué)的方法進(jìn)行酶的固定化，所得固定化酶不僅保留了酶原有的高活性、高選擇性，克服了游離酶的缺點(diǎn)，而且有益于反應(yīng)的連續(xù)化和自動(dòng)化，在工業(yè)生產(chǎn)上具有極高的應(yīng)用價(jià)值，因而具有廣闊的發(fā)展前景[6].

采用傳統(tǒng)的無(wú)機(jī)/有機(jī)復(fù)合材料或天然高分子固體材料為載體進(jìn)行α-淀粉酶的固定化，由于受到載體材料的影響，實(shí)現(xiàn)α-淀粉酶重復(fù)利用性的同時(shí)，酶活性卻大大降低.基于水凝膠具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，能夠吸收大量的水，溶脹而不溶解的性質(zhì)，能夠提供酶催化反應(yīng)所需的微環(huán)境，保證酶分子的活性構(gòu)象運(yùn)動(dòng).本文以具有生物相容性的P(DMAA-co-AM)凝膠為載體固定α-淀粉酶，提高了α-淀粉酶的使用性能.

1 主要實(shí)驗(yàn)試劑

丙烯酰胺(AM，廣東汕頭西隴化工廠)；N,N-二甲基丙烯酰胺(DMAA，南通沃蘭化工有限公司)；α-淀粉酶(廣東環(huán)凱生物科技有限公司)；過(guò)硫酸銨(APS，廣東汕頭西隴化工廠)；N,N-亞甲基雙丙烯酰胺(MBA，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；可溶性淀粉(廣東汕頭西隴化工廠).

2 固定化α-淀粉酶的制備

分別取一定量的 N,N-二甲基丙烯酰胺(DMAA)和丙烯酰胺 (AM)溶于去離子水中，配成混合溶液，然后加入適量α-淀粉酶溶液充分?jǐn)嚢瑁蛊湫纬删鶆虻幕旌弦?，再加入一定量的交?lián)劑(N,N-亞甲基雙丙烯酰胺(MBA))和引發(fā)劑(過(guò)硫酸銨(APS))，攪拌均勻便得到反應(yīng)混合液.于50 ℃水浴鍋中充分反應(yīng)一定時(shí)間，即可得到P(DMAA-co-AM)固定化α-淀粉酶凝膠粗樣.最后用緩沖溶液充分沖洗制得的固定化α-淀粉酶凝膠粗樣，把附著在固定化酶凝膠表面的游離α-淀粉酶沖洗掉，即得固定化α-淀粉酶.

3 結(jié)果與討論

3.1 溫度對(duì)固定化α-淀粉酶活性的影響

圖1為溫度對(duì)固定化α-淀粉酶和游離酶活性的影響.由圖1可見(jiàn)，在30～90 ℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，固定化酶和游離酶的活性均呈先升后降的趨勢(shì).游離酶的活性在50 ℃時(shí)達(dá)到最大，而固定化酶的最大活性溫度提高10℃.當(dāng)反應(yīng)溫度超過(guò)固定化酶和游離酶各自的最大活性溫度后，隨著溫度升高，游離酶活性降低的趨勢(shì)較固定化酶活性降低的趨勢(shì)更顯著，說(shuō)明在較高溫度下固定化酶較游離酶具有較好的穩(wěn)定性.這是因?yàn)椋?淀粉酶被載體P(DMAA-co-AM)凝膠固定后，載體對(duì)α-淀粉酶分子構(gòu)象具有一定的保護(hù)作用，使固定化酶的活性受溫度的影響降低.

圖1 溫度對(duì)α-淀粉酶活性的影響

Fig.1Influence of temperature on relative activity of a-amylase

3.2 pH對(duì)固定化α-淀粉酶活性的影響

圖2為pH對(duì)固定化α-淀粉酶和游離酶活性的影響.由圖2可知，在pH為5.0～8.0的范圍內(nèi)，固定化酶和游離酶的活性隨反應(yīng)液pH的增大均呈先升后降的趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)測(cè)得最適pH分別為6.0和6.6，但固定化酶的最適pH有所拓寬.對(duì)于游離酶，當(dāng)反應(yīng)液pH大于6.0后，繼續(xù)增大pH，其活性明顯降低；而在pH為6.6～7.6范圍內(nèi)，固定化酶保持較高的活性，pH超過(guò)7.6后，隨pH的增大，固定化酶的活性急劇降低.這是因?yàn)椋甘且环N蛋白質(zhì)，構(gòu)成酶分子的氨基酸殘基的解離狀態(tài)影響酶分子中的電荷分布，從而影響不同pH條件下的酶活性，催化產(chǎn)物呈現(xiàn)的電性也影響酶的最適pH.α-淀粉酶分解可溶性淀粉，生成以麥芽糖為主的產(chǎn)物，在pH<7的環(huán)境中-OH中的H易解離出來(lái)，改變?nèi)芤旱膒H大小，導(dǎo)致固定化酶的最適pH向高pH處偏移.在可溶性淀粉的分解中，α-淀粉酶的催化能力對(duì)pH很敏感，當(dāng)反應(yīng)液pH值高于最適pH值后，游離酶的活性明顯降低，游離酶的催化能力急劇下降.而α-淀粉酶被P(DMAA-co-AM)凝膠固定后，α-淀粉酶分子結(jié)構(gòu)受到凝膠網(wǎng)絡(luò)的保護(hù)，使其在較高的pH范圍仍具有較好的活性，說(shuō)明固定化酶活性對(duì)pH具有很好的穩(wěn)定性.

圖2 pH對(duì)α-淀粉酶活性的影響

3.3 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

圖3 固定化α-淀粉酶和游離酶的米氏方程

Fig.3Michaelis-Menten Kinetics equation of free and immobilization a-amylase

本實(shí)驗(yàn)中，取適量的固定化α-淀粉酶和游離酶分別與20 mL不同濃度的可溶性淀粉溶液在各自適宜的pH和溫度下精確反應(yīng)20 min，計(jì)算出其反應(yīng)速率，然后用雙倒數(shù)作圖法以1/V對(duì)1/[S]作圖，得到圖3.游離酶的米氏方程為：Y=0.39047+2.01403X，R=0.9976(Y代表1/V，X代表1/[S]，下同)；固定化α-淀粉酶的米氏方程為：Y=1.92746+2.56425X，R=0.9988.結(jié)合米氏方程，由圖3求出游離酶的米氏常數(shù)(Km)和最大反應(yīng)速率(Vmax)分別為5.16 mg/mL和2.56 mg/min；固定化酶的米氏常數(shù)(Km)和最大反應(yīng)速率(Vmax)分別為1.33 mg/mL和0.52 mg/min.固定化α-淀粉酶的米氏常數(shù)小于游離酶的，說(shuō)明固定化酶具有更好的底物親和性.P(DMAA-co-AM)凝膠網(wǎng)絡(luò)與α-淀粉酶分子間的物理或化學(xué)作用，促使固定化α-淀粉酶更傾向于與淀粉溶液親和.固定化α-淀粉酶的最大反應(yīng)速率小于游離酶的，是由于游離酶均勻地分散在淀粉溶液中，而固定化α-淀粉酶被束縛在P(DMAA-co-AM)凝膠網(wǎng)絡(luò)中，與淀粉溶液的接觸機(jī)會(huì)少于游離酶與淀粉溶液的接觸機(jī)會(huì)，導(dǎo)致固定化酶的Vmax較小.

3.4 固定化α-淀粉酶的操作穩(wěn)定性

圖4 固定化α-淀粉酶的操作穩(wěn)定性

Fig.4The operational stability of immobilization a-amylase

圖4是固定化α-淀粉酶重復(fù)操作6次表現(xiàn)出的穩(wěn)定性.在溫度為60 ℃和pH=6.6的條件下，適量的固定化α-淀粉酶與20 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的可溶性淀粉溶液反應(yīng)，測(cè)出其酶活力，計(jì)第一次測(cè)得的酶活為100%，以重復(fù)6次反應(yīng)的酶相對(duì)活性作柱狀圖得圖4.由圖4可知，固定化α-淀粉酶重復(fù)操作6次后，酶活仍可達(dá)到73%，說(shuō)明固定化α-淀粉酶的操作穩(wěn)定性良好.酶活下降的主要原因是，在制備固定化α-淀粉酶的過(guò)程中，為將粘附在固定化酶凝膠表面的游離α-淀粉酶除去，雖然用緩沖溶液充分洗滌，但在實(shí)際操作中仍會(huì)有部分游離酶粘附在固定化酶凝膠表面未被除掉.因此，固定化α-淀粉酶重復(fù)操作時(shí)，不可避免地會(huì)有α-淀粉酶流失，致使循環(huán)使用α-淀粉酶分解可溶性淀粉時(shí)酶活性表現(xiàn)出依次降低的現(xiàn)象.

3.5 固定化α-淀粉酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性

將固定化α-淀粉酶和游離酶儲(chǔ)存在4 ℃冰箱中每隔10天分別測(cè)其酶活性，其中分別計(jì)其初始酶活為100%，固定化酶和游離酶受儲(chǔ)存時(shí)間的影響如圖5所示.從圖5可以看出，儲(chǔ)存一定時(shí)間后，固定化α-淀粉酶的活性較游離酶降低趨勢(shì)平緩；儲(chǔ)存70天后，固定化α-淀粉酶可保持近60%的酶活，而游離酶的活性已降至26%.因?yàn)橛坞x的α-淀粉酶經(jīng)儲(chǔ)存后，酶分子構(gòu)象發(fā)生變化，酶活性下降，而固定化α-淀粉酶因受載體保護(hù)，分子構(gòu)象不易改變，使固定化酶活性下降趨勢(shì)減緩，因此固定化α-淀粉酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性較游離酶明顯提高.

圖5 游離酶和固定化α-淀粉酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性

Fig.5The storage stability of free and immobilization a-amylase

4 結(jié) 論

以P(DMAA-co-AM)凝膠為載體，通過(guò)原位固定法制備了固定化α-淀粉酶，改善了游離酶理化性質(zhì)不穩(wěn)定、易失活變性，不能重復(fù)使用等缺點(diǎn).固定化酶具有更好的底物親和性，固定化酶和游離酶的米氏常數(shù)(Km)分別為1.33，5.16 mg/mL，最大反應(yīng)速率(Vmax)分別為0.52，2.56 mg/min.與游離酶相比，固定化酶具有良好的操作穩(wěn)定性和儲(chǔ)存穩(wěn)定性.固定化α-淀粉酶的活性最適溫度為60℃，較游離酶提高了10 ℃；固定化α-淀粉酶的酶活最適pH由游離酶的6.0提高到了6.6.α-淀粉酶經(jīng)載體固定后具有更好的溫度和pH穩(wěn)定性，同時(shí)拓寬了α-淀粉酶的溫度和pH使用范圍.α-淀粉酶經(jīng)過(guò)載體固定化后的性能得到明顯改善，這為α-淀粉酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用提供了重要依據(jù).

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