焦艷華,梁媛媛,郭衛(wèi)強

(杭州師范大學(xué)材料與化學(xué)化工學(xué)院，浙江 杭州 310036)

人絨毛膜促性腺激素(Human Chorionic Gonadotropin，HCG)是由胎盤滋養(yǎng)層細胞分泌的糖蛋白激素.HCG分泌量不僅與胎兒正常發(fā)育有關(guān)，而且還是腫瘤、葡萄胎、毛絨癌等疾病的征兆和避孕疫苗的一個重要指標.因此研究HCG水平的變化具有重要的臨床意義，建立簡便、快速、靈敏的HCG測定方法是人們研究的焦點[1-3].目前已報道的HCG測定方法中有放射免疫分析[4]、電化學(xué)免疫分析[5]、熒光免疫分析[6]和化學(xué)發(fā)光免疫分析[7-9]等.

磁性高分子微球是近年發(fā)展起來的一種新型功能材料，它是將具有超順磁性納米粒子與單體通過聚合的方法制得一種膠態(tài)液體復(fù)合物，它除具有納米顆粒的特征外，還可以通過表面的功能基團進行各種表面的功能化修飾；而且，它具有超順磁性，可在外加磁場的作用下快速移動和分離.將磁性高分子微球引入到化學(xué)發(fā)光檢測技術(shù)中，不但可以大大提高檢測反應(yīng)的比表面積，而且磁性高分子微球的順磁性也可以幫助檢測的快速分離，縮短檢測時間.Zhang等[10]利用磁性微球作為固相載體檢測人血清中AFP的含量.通過對59個人血清樣本進行檢測，與商業(yè)化的電化學(xué)發(fā)光免疫檢測試劑盒相比,結(jié)果具有良好的一致性.Wang等[11]建立基于磁性微球的化學(xué)發(fā)光酶免疫法檢測糖抗原50(CA50)，檢測的線性范圍為0～300 U/mL，完成整個操作只需50 min.化學(xué)發(fā)光磁酶免疫方法具有靈敏度高、線性范圍廣、特異性高、準確性好等特點[12-13]，采用這種方法進行HCG檢測可以達到較高的檢測靈敏度.

目前，商業(yè)化的磁性微球及配套產(chǎn)品主要依靠進口，價格昂貴，難以在國內(nèi)大多數(shù)中小醫(yī)院推廣使用.因此，磁性微球及檢測試劑盒的研制迫在眉睫.本文以本實驗室制備的表面富含羧基的磁性高分子復(fù)合微球作為免疫檢測固相載體，采用EDC/NHS活化磁性微球表面的羧基，并在此基礎(chǔ)上將抗β-HCG的抗體固定在磁球表面，制備得到免疫磁性微球.然后以制備得到的免疫磁球為載體，建立基于磁性微球的化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法，并研究影響化學(xué)發(fā)光免疫檢測的各項因素.

1 實驗部分

1.1 試 劑

丙烯酸，CP，上海五聯(lián)化工廠；苯乙烯，CP，阿拉丁試劑公司；二聯(lián)吡啶(BPY)，AR，阿拉丁試劑公司；氯化亞銅，AR，阿拉丁試劑公司；環(huán)己酮，AR，杭州高晶精細化工有限公司；EDC上海源葉生物科技公司；NHS上海晶純試劑有限公司；戊二醛，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；CDP-star，Roche公司；堿性磷酸酶(ALP)，上海源葉生物科技公司；HCG抗原及抗體，北京博奧森科技公司.

1.2 制備方法

1.2.1 磁性微球的制備

Fe3O4磁性粒子的制備及其表面改性方法參照文獻進行[14].取100 mL三口燒瓶，加入40 mL環(huán)己酮，通氮氣15 min，取表面包覆了對氯甲基苯甲酸的納米Fe3O4磁性粒子1.0 g，BPY 0.35 g，CuCl 0.08 g，苯乙烯6 mL及丙烯酸3 mL.以220 r/min的速度機械攪拌，加熱到90 ℃，恒溫反應(yīng)12 h后，冷卻到室溫，磁性分離，清洗數(shù)次，便得到表面富含羧基的聚苯乙烯磁性微球.

1.2.2 酶標記抗體的制備

采用改良的戊二醛法：取堿性磷酸酶0.5 mg和單克隆抗體0.2 mg，分別溶于生理鹽水中，混合兩液.最終體積控制在0.5 mL，磁力攪拌下，加入0.05 mL1%戊二醛.室溫攪拌15 min后，避光反應(yīng)4 h，加入0.1 mL 1 M的乙醇胺，室溫孵育2 h.加入PBS，4 ℃透析過夜，中間換液3次.產(chǎn)物中加入等量甘油和0.1%Proclin-300，分裝，冰箱4 ℃存放備用.

1.2.3 免疫磁性微球的制備

取2 mg磁性高分子微球分散在200 μL的PB緩沖液中，加入0.5 mg的EDC和0.5 mgNHS，室溫振蕩反應(yīng)15 min，在外加磁場作用下除去上清液，用PB洗滌液洗滌1次.加入200 uL PB緩沖液及150 μg的抗β-HCG抗體，室溫搖床振搖2 h，磁性分離，除去上清液，用PBS洗滌3次，加PBS配成一定濃度的免疫磁性微球懸浮液，放入4 ℃冰箱保存待用.

1.2.4 化學(xué)發(fā)光法檢測HCG

取10 μL的免疫磁性微球，加入40 μL的HCG抗原溶液和50 μL的ALP-HCG抗體溶液，搖勻，37 ℃水浴振搖1 h.反應(yīng)結(jié)束后，用PBS洗滌，磁性分離，除去上層清液，重復(fù)5次.加入100 μL的化學(xué)發(fā)光底物CDP-star溶液，混勻，用多功能酶標儀檢測其化學(xué)發(fā)光強度.

2 結(jié)果與討論

2.1 化學(xué)發(fā)光檢測時間的選擇

每隔10 min對此發(fā)光體系檢測一次，從圖1中可以看出隨著時間的延長，0～30 min內(nèi)化學(xué)發(fā)光強度在逐漸增強，這是因為ALP催化AMPPD發(fā)光過程分為兩個階段：在ALP的催化下，AMPPD首先脫去一個磷酸基，得到一個AMPD陰離子，然后這個AMPD離子經(jīng)分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移裂解為一分子的金剛烷酮和一個處于激發(fā)態(tài)的間氧苯甲酸甲酯陰離子.激發(fā)態(tài)的間氧苯甲酸甲酯離子躍遷到基態(tài)的過程中會產(chǎn)生光子.而AMPD一般有2～30 min的半衰期，所以當(dāng)反應(yīng)超過30 min時，反應(yīng)的發(fā)光強度基本處于穩(wěn)定狀態(tài)，繼續(xù)延長檢測時間，反應(yīng)的光強度也是基本保持不變.因此，為了提高檢測速度，檢測時間選擇在30 min左右較為理想.

2.2 磁微球濃度的選擇

免疫磁珠是將抗體等生物活性物質(zhì)包被在功能化的磁性復(fù)合微球上，形成一種可以跟檢測目標物質(zhì)特異性結(jié)合的復(fù)合磁珠.利用這種磁珠可以檢測、分離純化各種抗原、抗體、蛋白、核酸等生命活性物質(zhì)，在生物學(xué)中的應(yīng)用相當(dāng)廣泛.

從圖2可以看出隨著免疫磁性微球濃度的增加，化學(xué)發(fā)光強度迅速增加.當(dāng)磁珠濃度達到5 mg/mL時，發(fā)光強度達到最大.若進一步加大磁珠使用濃度時，化學(xué)發(fā)光強度會降低，這是因為磁微球懸濁液會吸收穿過溶液的光，濃度越高吸收越多，磁微球的濃度超過5 mg/mL后，化學(xué)發(fā)光強度開始減弱.因此，為保證檢測時的發(fā)光強度, 實驗中選擇磁性微球的量為5 mg/mL.

圖1 檢測時間的選擇

圖2 免疫磁珠的濃度對發(fā)光強度的影響

2.3 酶標抗體濃度的影響

首先將ALP標記的anti-βHCG抗體溶液依次稀釋到12 mg/L、6 mg/L、3 mg/L、1.5 mg/L、0.75 mg/L.取10 μL的免疫磁性微球，加入300 IU/L的HCG抗原溶液40 μL，然后加入以上不同濃度的酶標抗體溶液50 μL，混勻，室溫孵育60 min，清洗5次，然后加入發(fā)光底物檢測化學(xué)發(fā)光強度，結(jié)果如圖3所示.實驗結(jié)果表明，當(dāng)反應(yīng)體系中無ALP-HCG抗體時，發(fā)光強度很低，隨著ALP-HCG抗體濃度的增加，發(fā)光強度迅速增強，但是到6 mg/L后幾乎不再增加.因此實驗中選擇ALP-HCG的濃度為6 mg/L.

2.4 反應(yīng)孵育時間的選擇

固定HCG抗原的濃度為200 IU/L，酶標抗體濃度為6 mg/L，磁微球加入量為50 μg時，將反應(yīng)孵育時間設(shè)定為10 min，20 min、40 min、50 min、60 min、90 min，檢測反應(yīng)孵育時間對發(fā)光強度的影響，結(jié)果如圖4所示.從圖4可以看出，開始隨著孵育時間的延長，化學(xué)發(fā)光強度是增強的，但到了60 min后化學(xué)發(fā)光強度不再增強，因此合適的反應(yīng)孵育時間為60 min.

圖3 酶標抗體濃度的影響

圖4 孵育時間對發(fā)光強度的影響

2.5 HCG標準曲線的繪制

用PBS溶液對HCG原液進行梯度稀釋, 形成不同濃度的HCG 溶液，在最優(yōu)化的配比和檢測條件下, 對0.5～300 IU/L的HCG 樣品進行檢測得知，HCG濃度與檢測發(fā)光強度呈線性關(guān)系(如圖5所示).其檢出限為0.32 IU/L,線性范圍為0.5～300 IU/L，線性方程為y=1.0464x+297.91，標準曲線的線性相關(guān)系數(shù)為r=0.990，線性較好，線性范圍較寬.

圖5 HCG濃度與發(fā)光強度的線性關(guān)系

3 總 結(jié)

將化學(xué)發(fā)光方法的靈敏性、磁分離技術(shù)的快速性和酶免疫分析的特異性結(jié)合在一起，建立一種磁酶聯(lián)化學(xué)發(fā)光免疫分析方法，并對檢測條件進行了優(yōu)化.在磁性高分子微球的表面偶聯(lián)上抗β-HCG的抗體得到免疫磁珠，用來檢測HCG，繪制了HCG標準曲線，線性關(guān)系為y=1.0464x+297.91，線性相關(guān)系數(shù)為r=0.990，線性較好，線性范圍較寬.這種檢測方法操作簡便，檢測時間大大縮短，重現(xiàn)性良好，可自動化程度高.

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