吳 丹

(江蘇省無錫市第二人民醫(yī)院 心內科, 江蘇 無錫, 214002)

已有許多研究[1]提示了中樞內血管緊張素Ⅱ對心衰發(fā)展可能的促進作用。而SD大鼠腦片膜片鉗的研究，進一步揭示了通過血管緊張素作用于AT1型受體進而影響到下丘腦神經元細胞的興奮性的離子機制[2]。本實驗探討PVN內AT1-R的蛋白表達變化情況，以期進一步證實中樞內包括血管緊張素Ⅱ及AT1-R介導的對于心衰可能的促進作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性Spreague-Dawley(SD)大鼠。體質量(200±20) g。購自南通大學實驗動物中心。實驗動物合格證號：2082871。

1.2 主要試劑

水合氯醛、α-氯醛糖、羊抗兔IgG FITC 熒光二抗、Triton X-100、多聚甲醛、Hoechst33342: Sigma、二抗(goat anti-rabbit IgG-HRP): Santa Cruz; 抗AT1-R一抗: abcam; Tris 三(羥甲基)氨基甲烷：上海生工、青霉素：華北制藥廠; RIPA裂解液、PMSF(100mM)、BCA蛋白濃度測定試劑盒、5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、BeyoECL Plus(超敏ECL化學發(fā)光試劑盒)、抗熒光淬滅封片液、彩色預染蛋白質分子量標準、PVDF膜(進口分裝)、Actin抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)：海門碧云天；無水乙醇、甲醇：國藥集團化學試劑有限公司、鹽酸：汕頭市西隴化工廠有限公司、氫氧化鈉：南京化學試劑有限公司；AP(過硫酸銨)、SDS(十二烷基磺酸鈉)、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tween-20、L-甘氨酸、TEMED(N, N, N′,N′-四甲基二乙胺) ：合肥博美生物科技有限責任公司。

1.3 主要儀器

ALC-V8動物呼吸機(上海奧爾科特生物科技有限公司)，VIVID-7 型彩色多普勒超聲診斷儀(美國GE公司)，JY10001型電子天平(上海精密科學儀器有限公司)，超低溫冰箱(日本SANYO), BCD-254型冰箱(德國SIEMENS)，Eppendorf5417R冷凍離心機(德國)，101AB-2型電熱恒溫干燥箱(江蘇海門恒昌儀器廠)，DK-8A電熱恒溫水槽(上海華聯環(huán)境試驗設備公司恒昌儀器廠), Synergy-2多功能酶標儀(Biotek)，CM-1900UV冷凍切片機(Leica), DM4000B研究級正置熒光顯微鏡(Leica)，基礎電泳儀(BioRad)，小型垂直電泳槽(BioRad)，小型轉膜槽(BioRad)，超高靈敏度化學發(fā)光成像系統(tǒng)(ChemiDocXRS+)(BioRad)。

1.4 心衰大鼠模型制作與分組

將20只健康雄性清潔級SD大鼠隨機分為手術組10只與假手術組10只。用結扎大鼠冠脈左前降支(LAD)的方法構建慢性心力衰竭大鼠模型。術后6周，2組大鼠采用VIVID-7 型彩色多普勒超聲診斷儀測量二維超聲心動圖，對大鼠心臟進行掃查。采用EF值<42%作為評定心力衰竭的診斷標準[5]。所有大鼠術后6周即行處死、取材，備以下實驗所用。Western Blot技術(隨機抽取5只心衰及5只假手術組)或免疫熒光技術的檢測(隨機抽取5只心衰及5只假手術組)。通過 Western Blot技術檢測室旁核內AT1-R的表達情況。大鼠斷頭，迅速取出腦，轉移至液氮中，隨后儲存在-70 ℃的條件下，迅速從冰箱中取出冰凍的腦，用冰凍切片機切片。切片厚度：300 m(60 m×5)。在冰上操作，用穿孔器，根據大鼠腦定位圖譜(Watson & Paxinos)，在1 mm厚(距前囟點-0.84 mm～-2.28 mm)的雙側腦片的PVN所在區(qū)域，打孔，提取PVN至Eppendorf管中。再進行蛋白質抽提、蛋白定量，配制10%的SDS-PAGE分離膠、配制5%的濃縮膠、灌膠、電泳、轉膜、封閉及加入抗體孵育、顯影、使用Quantity One軟件分別測定目的蛋白及相應內參條帶的面積和灰度值的乘積，進而計算上述兩者面積和灰度值乘積的比值，來表示蛋白的表達水平。使用免疫熒光技術檢測AT1-R的免疫組織化學表達情況。大鼠麻醉后行心臟多聚甲醛灌注，取腦后行冰凍切片，每只大鼠取20張PVN腦片，選取5個冠狀位切面觀測AT1-R陽性神經元分布情況，并作陰性對照。將腦片貼片后，用AT1-R的一抗保濕孵育，漂洗后，使用羊抗兔IgG-FITC(二抗)保濕避光孵育并漂洗。使用核染色劑Hoechst33342標記細胞核。保濕避光孵育后漂洗。封片后使用熒光正置顯微鏡鏡檢。觀測5個冠狀位切面腦片上AT1-R陽性神經元的分布及數量，并作統(tǒng)計。用物鏡40倍分別拍片。每張腦片在物鏡40倍下，隨機取4個PVN視野，計數陽性神經元數量的總和，比較心衰與假手術組AT1-R三種蛋白之間的表達差異。

1.5 統(tǒng)計學方法

實驗數據均為計量資料，采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學分析。使用兩獨立樣本均數的t-檢驗來進行統(tǒng)計學分析，所有結果用平均值±標準差表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

心衰組與假手術組心超測定的EF值比較，心衰組大鼠的左心室收縮期內徑(LVIDs)、射血分數(EF%)及短軸縮短率(FS%)較假手術組明顯降低。見表1。

表1 2組大鼠心超結果比較

與假手術組比較，*P<0.05。

Western Blot技術檢測室旁核內AT1-R的表達情況顯示，心衰組室旁核內的AT1-R表達明顯高于假手術組[(1.69±0.85)、(0.49±0.31),P<0.05], 差異有統(tǒng)計學意義。見圖1、表2。

表2 2組Western Blot檢測室旁核內AT1-R結果

免疫熒光技術檢測室旁核內AT1-R的表達情況顯示，心衰組室旁核內的AT1-R表達明顯高于假手術組[分別為(821.00±79.25)、(466.40±68.86)，P<0.05], 差異有統(tǒng)計學意義。見圖2、表3。

表3 2組免疫熒光技術檢測室旁核內AT1-R結果

3 討 論

作者采用Western blot 及免疫熒光的方法所獲得的實驗結果表明，心梗后心衰SD大鼠PVN中血管緊張素Ⅱ1型受體(AT1-R)的蛋白表達及分布密度比假手術組明顯增加。與他人的研究結果，即心梗后AT1-R及血管緊縮素轉化酶(ACE)的mRNA、蛋白表達水平在穹隆下器(SFO)、PVN等神經核團中明顯增加[3-4]相一致。提示血管緊張素Ⅱ通過中樞內AT1-R介導的機制影響心衰的進程。有研究[2,5-6]證實中樞血管緊張素Ⅱ可促進心室重構而加重心衰。上述通路可活化血管緊張素能通路并進一步提高交感神經活性，而促進心衰的發(fā)展。由于血管緊張素Ⅱ可通過激活血管緊張素Ⅱ1型受體及介導多種陽離子電流的離子通道，興奮支配延髓頭端腹外側(RVLM)的PVN神經元[7], 因此作者推測中樞血管緊張素Ⅱ通過具有投射至腦干心血管調控中樞(延髓頭端腹外側核, RVLM)的纖維的PVN神經元表達的AT1-R，來影響交感神經沖動外流進而促進心衰進展。

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[5] Leenen F H H, Huang B S, Yu H, et al. Brain′ouabain′mediates sympathetic hyperactivity in congestive heart failure[J]. Circ Res, 1995, 77(5): 993.

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