鄭丹，楊家鋒，鐘惠英，姜小敏

（寧波市漁業(yè)環(huán)境與產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)監(jiān)測(cè)中心，浙江寧波 315012）

硝基呋喃類藥物(Nitrofuran antibiotics)作為一類廣譜抗生素被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物飼料和治療藥物中，由于硝基呋喃在治療動(dòng)物腸胃病方面效果明顯，故被應(yīng)用于南美白對(duì)蝦育苗環(huán)節(jié)。研究表明該類藥物可能誘導(dǎo)有機(jī)體基因突變且具有遺傳毒性，歐美等國(guó)已將其列為違禁藥物，我國(guó)也將其列為食品動(dòng)物的禁用獸藥。硝基呋喃類藥物主要包括呋喃唑酮(Furanzolidone)、呋喃西林(Nitrofurazone)、呋喃妥因(Furantoin)、呋喃它酮(Furaltadone)4種，該類藥物在動(dòng)物體內(nèi)會(huì)迅速分解，其代謝物可與蛋白質(zhì)緊密結(jié)合形成穩(wěn)定殘留，因此目前通常以測(cè)定其代謝物的方式來(lái)說(shuō)明硝基呋喃類藥物在動(dòng)物體內(nèi)的含量［1-10］。

南美白對(duì)蝦是寧波市水產(chǎn)養(yǎng)殖主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)之一，是寧波市水產(chǎn)品出口創(chuàng)匯的少數(shù)優(yōu)勢(shì)品種，因此保證南美白對(duì)蝦的食用安全對(duì)于保障百姓身體健康和擴(kuò)大出口至關(guān)重要。隨著百姓對(duì)食品安全問(wèn)題的日益關(guān)注以及政府對(duì)水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管的重視，水產(chǎn)苗種作為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)重要的投入品，它的安全關(guān)系到水產(chǎn)品安全問(wèn)題的源頭，也是各級(jí)漁業(yè)行政主管部門主抓的工作之一，因此測(cè)定南美白對(duì)蝦苗中的硝基呋喃類抗生素代謝物有重要意義。

近年來(lái)高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)越來(lái)越多地應(yīng)用于硝基呋喃類代謝物殘留的測(cè)定，與高效液相色譜紫外檢測(cè)器法比較，質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式，結(jié)合液相保留時(shí)間及MRM特征離子對(duì)進(jìn)行定性和定量分析，可以大大減少由于保留時(shí)間相同而待測(cè)離子不同所帶來(lái)的干擾，并且提高了檢測(cè)靈敏度，尤其適合于基質(zhì)復(fù)雜樣品的分析，將這一技術(shù)應(yīng)用于南美白對(duì)蝦苗種硝基呋喃類代謝物殘留測(cè)定，將有利于漁業(yè)行政主管部門對(duì)水產(chǎn)苗種企業(yè)的監(jiān)管和水產(chǎn)品質(zhì)量安全的提升［11-17］。目前尚無(wú)高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(HPLC-MS/MS)測(cè)定南美白對(duì)蝦苗種中硝基呋喃類抗生素代謝物的相關(guān)報(bào)道。筆者對(duì)該方法進(jìn)行了研究，確定了實(shí)驗(yàn)條件，所建方法測(cè)定結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度滿足藥物殘留檢測(cè)要求。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：Waters 2695-Quattro micro mass型，美國(guó)Waters公司；

超聲波清洗機(jī)：KS-120D型，寧波科生公司；

均質(zhì)機(jī)：DJ-Ⅱ型，上海炳隆機(jī)電公司；

漩渦混勻儀：MS3數(shù)顯型，德國(guó)IKA公司；

恒溫水浴搖床：SHA-C型，常州國(guó)華公司；

臺(tái)式離心機(jī)：DL-8M型，上海離心機(jī)械研究所；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：R215型，瑞士BUCHI公司；

分析天平：BP211D Ma型，感量為0.000 1 g，德國(guó)Sartorius公司；

乙酸乙酯：分析純；

乙腈、甲酸、2-硝基苯甲醛：色譜純；

鹽酸溶液：0.2 mol/L；

氫氧化鈉溶液：2.0 mol/L。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

表1列出了硝基呋喃代謝物的名稱。

表1 硝基呋喃代謝物名稱及縮寫(xiě)

AOZ，AMOZ，SEM ·HCl，AHD ·HCl標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：純度不低于98%；

同位素內(nèi)標(biāo)溶液：AOZ-D4，AMOZ-D5，AHD-13C3和 SEM ·HCl-13C-15N2，質(zhì)量濃度均為 100 μg/mL ；

AOZ，AMOZ，SEM，AHD標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：質(zhì)量濃度均為1.0 mg/mL，分別準(zhǔn)確稱取一定量AOZ，AMOZ，SEM，AHD，用甲醇溶解并分別定容至10 mL棕色容量瓶中，4℃冷藏保存；

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：準(zhǔn)確吸取AOZ，AMOZ,SEM,AHD標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用流動(dòng)相[乙腈-甲酸緩沖溶液（體積比20∶80）]逐級(jí)稀釋配制成100 ng/mL和10 ng/mL混合溶液，于4℃冷藏保存；

混合內(nèi)標(biāo)工作溶液：準(zhǔn)確吸取同位素內(nèi)標(biāo)溶液，用甲醇逐級(jí)稀釋配成50 ng/mL混合溶液，于4℃冷藏保存。

1.3 樣品采集

南美白對(duì)蝦苗及對(duì)應(yīng)苗池水樣品取自2007～2011年每年4～5月間，樣品采集覆蓋了寧波市慈溪、寧海、象山、鄞州、奉化等南美白對(duì)蝦苗主要生產(chǎn)區(qū)，涵蓋了寧波市大型育苗場(chǎng)的95%，抽取苗種規(guī)格均為0.7～1.0 cm仔蝦。

1.4 樣品前處理

取南美白對(duì)蝦苗樣用均質(zhì)機(jī)制成均質(zhì)糜樣備用，稱取樣品2.0 g(精確到0.01 g)于50 mL離心管中，加入200 μL混合內(nèi)標(biāo)工作溶液，再加入10 mL 0.2 mol/L 鹽酸溶液和 100 μL 2-硝基苯甲醛，渦旋振蕩50 s后，置于恒溫水浴振蕩器中37℃避光振蕩16 h。取出離心管冷卻至室溫，加入1.0 mol/L氫氧化鈉溶液約2.0 mL，再調(diào)節(jié)pH至7.0～7.5，加入 10 mL 乙酸乙酯，渦旋振蕩 50 s，以4 000 r/min 離心5 min，取上層清液轉(zhuǎn)移至50 mL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)瓶中，再加入10 mL乙酸乙酯，重復(fù)上述操作，合并上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，準(zhǔn)確加入1.0 mL乙腈-甲酸緩沖溶液（體積比20∶80），渦旋振蕩溶解殘留物，過(guò)0.45 μm濾膜，待測(cè)。標(biāo)準(zhǔn)工作曲線制作時(shí)，用100 ng/mL和10 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液配制系列標(biāo)準(zhǔn)使用液，不加樣品，其余等同樣品前處理過(guò)程。

1.5 儀器工作條件

1.5.1 色譜條件

色譜柱：SHISEIDO MGⅢC18柱(2.0 mm×100 mm)；流動(dòng)相：乙腈-甲酸緩沖溶液(體積比20∶80），梯度洗脫（洗脫程序見(jiàn)表2），流速為0.2 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣體積：10 μL；進(jìn)樣時(shí)間：20 min。

1.5.2 質(zhì)譜條件

離子化模式：大氣壓電噴霧離子源（ESI），正離子模式；離子源溫度：120℃；脫溶劑氣流：600 L/h；掃描模式：選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式；選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)母離子、子離子和碰撞能量見(jiàn)表3。

表2 流動(dòng)相梯度洗脫程序

表3 選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)4種硝基呋喃類藥物代謝物的質(zhì)譜條件

2 結(jié)果與分析

2.1 衍生化時(shí)間對(duì)回收率的影響

衍生化時(shí)間的設(shè)定對(duì)樣品測(cè)定結(jié)果有很大影響，如圖1所示。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)衍生化時(shí)間超過(guò)12 h后，AOZ，SEM回收率較好且穩(wěn)定，而AMOZ，AHD衍生時(shí)間達(dá)到16 h才有穩(wěn)定的回收率。當(dāng)衍生時(shí)間小于12 h時(shí)，4種硝基呋喃類代謝物不能保證每次都衍生完全，盡管AOZ在衍生化6 h就能有較好回收率，但回收率并不穩(wěn)定，且并未隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈比例增大。因此同時(shí)測(cè)定硝基呋喃4種代謝物時(shí)，應(yīng)選擇衍生時(shí)間大于16 h。

圖1 不同衍生化時(shí)間對(duì)回收率的影響

2.2 色譜柱的選擇

考察了Waters atlantis C18(2.1 mm×150 mm)柱和SHISEIDO MGⅢC18(2.0 mm×100 mm)柱對(duì)待測(cè)物的分離效果，結(jié)果表明，SHISEIDO MGⅢC18柱靈敏度高于waters atlantisC18柱，而waters atlantisC18柱的穩(wěn)定性較好，綜合考慮選擇SHISEIDO MGⅢC18柱。

2.3 流動(dòng)相的選擇

考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-2 mmol/L乙酸銨、乙腈-1‰甲酸溶液等不同流動(dòng)相對(duì)4種硝基呋喃代謝物的色譜行為和離子化程度的影響。結(jié)果表明，以乙腈-1‰甲酸溶液作為流動(dòng)相時(shí)，可獲得最優(yōu)的色譜分離效果和質(zhì)譜信號(hào)響應(yīng)。

2.4 工作曲線方程、檢出限和定量限

配制質(zhì)量濃度為0.2～50 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照樣品的前處理方法進(jìn)行衍生化和提取后，利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行測(cè)定。以色譜峰面積(Y)對(duì)被測(cè)組分的質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行線性回歸，AOZ，AHD，SEM，AMOZ的回歸方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表4。在陰性樣品基質(zhì)中添加4種標(biāo)準(zhǔn)溶液（AOZ，AMOZ的添加水平為0.10 μg/kg，SEM，AHD的添加水平為0.25 μg/kg），當(dāng)信噪比(S/N)大于5時(shí)，計(jì)算AOZ，AMOZ的檢出限為0.10 μg/kg，SEM，AHD的檢出限為0.25 μg/kg。在陰性樣品基質(zhì)中添加4種標(biāo)準(zhǔn)溶液（AOZ，AMOZ的添加水平為0.40 μg/kg，SEM，AHD的添加水平為0.50 μg/kg），當(dāng)信噪比 (S/N)大于 10時(shí)計(jì)算 AOZ，AMOZ的定量下限為0.40 μg/kg，SEM，AHD的定量下限為 0.50 μg/kg，見(jiàn)表 4。

表4 工作曲線方程、線性范圍、檢出限和定量限

2.5 方法回收率和精密度試驗(yàn)

選取陰性樣品，添加4種硝基呋喃類代謝物標(biāo)準(zhǔn)品和相應(yīng)內(nèi)標(biāo)，添加水平為 2.50，10.0 μg/kg，每個(gè)水平做6個(gè)平行加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

由表5可知，加標(biāo)回收率為88.2%～97.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.6%～6.8%，由此可見(jiàn)方法的精密度和準(zhǔn)確度較高。

3 結(jié)語(yǔ)

采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)建立了南美白對(duì)蝦苗的硝基呋喃類代謝物測(cè)定方法，對(duì)樣品前處理的提取凈化條件、液相色譜分離條件和串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定條件進(jìn)行了優(yōu)化。該方法具有穩(wěn)定性好、靈敏度高的特點(diǎn)，其線性、準(zhǔn)確度和精密度均能滿足藥物殘留測(cè)定要求。該方法樣品前處理過(guò)程簡(jiǎn)單、凈化效果好，適合于大批量樣品的快速檢測(cè)，該研究為政府相關(guān)部門對(duì)南美白對(duì)蝦苗硝基呋喃類代謝物的監(jiān)督提供了參考。

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