解杰 李麗珍 黃濤 王魯群 李顥 李湘新 王玲玲 李芳鄰

骨髓增生異常綜合征(MDS)是一組起源于造血干細胞的惡性克隆性疾病，其預后呈現(xiàn)明顯異質(zhì)性。根據(jù)1997年Greenberg提出的國際預后評分系統(tǒng)(IPSS)可將MDS分為低危組、中危-1組、中危-2組和高危組。低危組患者多表現(xiàn)為難治性貧血、白細胞和血小板減少，但原始病態(tài)造血的程度較輕，因而多數(shù)患者生存時間較長。近來研究證實，低危MDS患者骨髓微環(huán)境中一些應激性刺激可引起造血干/祖細胞過度凋亡從而導致骨髓無效造血和外周血細胞數(shù)減少[1]。細胞的高凋亡貫穿于疾病的各個階段，以難治性貧血(MDS-RA)及環(huán)形鐵粒幼細胞性難治性貧血(MDS-RAS)為著。目前，低危MDS的治療主要是對癥支持、低甲基化治療等，但療效不理想。血紅素加氧酶-1(HO-1)參與清除細胞內(nèi)氧自由基，減少細胞應激性凋亡，這種作用可能與MAPK 信號通路有關[2-3]。本研究通過檢測在不同濃度HO-1誘導劑Hemin干預下，低危MDS患者HO-1的表達水平的變化及HO-1基礎水平的變化與患者預后的關系，探討HO-1可能的作用機制和臨床靶向治療的可能。

對象與方法

一、研究對象

采集2008年9月至2012年9月在山東大學齊魯醫(yī)院血液科就診的60例初治低危MDS患者骨髓，其中男28例、女32例，年齡19～80歲、中位年齡55歲，病程0.5～8.3年、中位病程5.6年。病理分型包括：MDS-RA 45例、MDS-RAS 15例，MDS的診斷符合2008年WHO分型標準[4]。另外，采集同期在我院就診的缺鐵性貧血(IDA)患者20例的骨髓作為對照，男9例、女11例，年齡20～78歲、中位年齡50歲。所有標本取材均獲得山東大學齊魯醫(yī)院倫理委員會批準，所有患者及家屬均簽署知情同意書。

二、方 法

用蛋白免疫印跡法檢測60例初診低危MDS患者骨髓單個核細胞(BMMNCs)中HO-1蛋白表達水平及JNK信號分子磷酸化水平的表達，并追蹤隨訪MDS患者無進展生存期(PFS)。

1.主要材料

胎牛血清和RPMI 1640培養(yǎng)液(Gibco公司)，Hemin(Sigma公司)，RIPA細胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)，c-Jun氨基末端激酶(JNK)和磷酸化JNK(p-JNK)、β-actin等一抗及二抗(Cell signaling technology公司)，HO-1一抗(Abcam公司)。

2.BMMNCs的提取與體外孵育

無菌條件下抽取患者骨髓5 mL，予乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，稀釋后加入Ficoll淋巴細胞分離液分離BMMNCs。將患者BMMNCs接種于含20%的胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，分為4組，每組接種細胞濃度為2×106/ml。第2～4組加入不同劑量HO-1誘導劑Hemin，使Hemin在體系中的終濃度分別為5、10、20 μM，第1組培養(yǎng)體系中加入等量無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)。于37℃、含5% 二氧化碳飽和濕度下培養(yǎng)48 h后收集細胞備用。

3.采用蛋白免疫印跡法檢測BMMNCs中HO-1蛋白和磷酸化JNK信號分子的表達

用RIPA細胞裂解液處理BMMNCs，提取總蛋白質(zhì)，測定蛋白濃度。按每孔50 μg蛋白上樣，10%～12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜上,用封閉液(含50 g/L脫脂牛奶的TBST緩沖液)室溫封閉2 h，加入一抗(1∶1 000)于4℃孵育過夜。第2日于室溫下洗膜后加入相應辣根過氧化物酶(HRP)耦聯(lián)羊抗兔二抗室溫孵育1 h，洗膜后用電化學發(fā)光法顯影。以β-actin條帶作為內(nèi)對照。目的蛋白顯色條帶灰度與內(nèi)參顯色條帶灰度比值代表目的蛋白相對表水平。

4.病例隨訪

隨訪截止日期為2013年10月。對可追蹤的60例患者進行PFS分析。PFS是從疾病確診日開始至死亡或疾病進展為止。低危MDS患者疾病進展定義為粒細胞或血小板數(shù)較最佳緩解/療效時下降≥50%或血紅蛋白下降≥20 g/L或原始細胞<5%者的原始細胞數(shù)增加≥50%達到5%。將隨訪終止時仍未發(fā)生疾病進展和死亡的患者以及失訪患者的生存期作為刪失值處理。

三、統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0軟件處理數(shù)據(jù)，單因素方差分析中用LSD-t檢驗進行組間蛋白表達量比較。進行Kaplan-Meier生存分析，并用Log-rank檢驗比較生存曲線。用COX風險比例模型分析HO-1對無進展生存期的影響。P<0.05為比較差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、低危MDS患者BMMNCs中HO-1蛋白的表達水平

60例低危MDS患者HO-1蛋白相對表達水平為0.450±0.248，與IDA患者水平0.4913±0.2377比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。用不同濃度(0、5、10、20 μM)的HO-1誘導劑Hemin體外孵育BMMNCs 48 h，HO-1蛋白相對表達水平分別為0.450±0.248、0.695±0.213、0.896±0.202、1.126±0.167，多組間比較差異有統(tǒng)計學意義(F值為18.938，P<0.01)，各組間兩兩比較差異均具有統(tǒng)計學意義(LSD-t檢驗的P值均<0.05)，提示隨著Hemin濃度的增加HO-1蛋白表達水平呈濃度依賴性逐漸升高，見圖1。

圖1 蛋白免疫印跡法檢測低危MDS患者骨髓單個核細胞中HO-1蛋白的表達

二、 HO-1對磷酸化JNK信號分子表達水平的調(diào)控

不同濃度Hemin孵育BMMNCs 48 h，隨著HO-1蛋白表達量的逐漸增高，磷酸化JNK信號分子相對表達水平在各組分別為0.412±0.217、0.632±0.245、0.861±0.221、1.112±0.233，多組間比較差異有統(tǒng)計學意義(F值為17.163，P<0.01)，各組間兩兩比較差異均具有統(tǒng)計學意義(LSD-t檢驗的P均<0.05)。提示隨著HO-1表達水平的升高，磷酸化JNK信號分子表達水平也逐漸升高，見圖2。

圖2 蛋白免疫印跡法檢測低危MDS患者骨髓單個核細胞中磷酸化JNK信號分子的表達

三、HO-1表達水平與低危MDS患者預后的關系

1.HO-1表達水平的高低對低危組患者PFS的影響

以低危MDS患者HO-1蛋白表達水平的均數(shù)0.450為界，將MDS患者分為兩組，超過0.450為高表達組，共30例(50%),小于0.450為低表達組，共30例(50%)。至隨訪截止日，60例患者中25例發(fā)生血液學疾病進展(41.7%)，7例進展為MDS-RA伴原始細胞增多4例或白血病3例(11.7%)。18例(30.0%)疾病好轉(zhuǎn)且穩(wěn)定，至隨訪結(jié)束日未發(fā)生進展；8例(13.3%)死亡(死亡原因為感染5例、嚴重出血2例、高齡1例)；2例(3.33%)失訪?？偟腜FS為32.8(6.4～57.6)個月，其中HO-1高表達組患者PFS為41.6(6.4～57.6)個月，低表達組為32.0(7.4～49.3)個月，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.047)。兩組無病生存率的比較見圖3。

2.COX回歸模型分析

將HO-1蛋白表達水平納入COX回歸模型中，結(jié)果顯示HO-1表達水平是判斷低危MDS患者預后的獨立影響因素(HR為0.048，95%CI為0.005～0.420，P=0.006，回歸系數(shù)為-3.043)。以上結(jié)果提示HO-1蛋白表達量的增加將減小低危MDS患者病情進展的可能性。

討 論

MDS造血細胞的高凋亡狀態(tài)貫穿于MDS從低危到高危的各個亞型。Raza于1997年提出低危MDS患者可出現(xiàn)多種凋亡信號轉(zhuǎn)導的改變，其中包括MAPK通路中的p38 傳導通路及抗凋亡傳導通路ERK、JNK等的異常調(diào)節(jié)，它們多造成DNA合成期階段的造血細胞凋亡，在高危亞型患者同樣存在凋亡過度的現(xiàn)象，但因其骨髓中出現(xiàn)代償性的惡性細胞增殖而掩蓋了此現(xiàn)象。骨髓細胞凋亡的調(diào)控如何影響低危MDS患者的預后，不同研究者均有相似見解。其中，骨髓造血細胞保護機制，如血紅素加氧酶/一氧化碳(HO-CO)系統(tǒng)、熱休克蛋白系統(tǒng)和集落刺激因子系統(tǒng)信號的調(diào)節(jié)可明顯抑制細胞凋亡。Navas等于2006年報道體外抑制低危MDS骨髓細胞凋亡，發(fā)現(xiàn)其造血祖細胞集落形成能力顯著增強，說明抑制細胞凋亡可明顯改善MDS患者骨髓造血。同年，Kim等通過體內(nèi)試驗將抗凋亡制劑(己酮可可堿、環(huán)丙沙星、地塞米松等)用于低危MDS患者，發(fā)現(xiàn)隨著骨髓造血細胞凋亡率的減低其外周血三系細胞數(shù)明顯提升，提示抑制造血細胞高凋亡可能是改善低危組MDS患者預后的一條新途徑。

HO-1 廣泛存在于機體的各個組織、器官，參與機體的氧化還原、組織修復及DNA修復等多種與細胞保護有關的反應，可通過抗氧化、抗應激、抗凋亡等發(fā)揮細胞保護作用[5-6]。有學者在小鼠移植模型中發(fā)現(xiàn)，HO-1單倍體基因突變導致其表達不足時，會使應激狀態(tài)下小鼠骨髓和脾臟各階段紅系造血細胞數(shù)目減少、鐵代謝再循環(huán)利用受阻、巨噬細胞分泌TNF-α等造血負調(diào)控因子增多，說明應激狀態(tài)下紅系祖細胞保持正常的增殖、代謝及分化成熟過程中HO-1起到關鍵的調(diào)節(jié)作用[7]。Morita等于2009年報道，他們的研究證明HO-CO信號系統(tǒng)的上調(diào)可以抑制p38MAPK途徑信號激活，調(diào)節(jié)骨髓基質(zhì)中干細胞因子(SCF)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的產(chǎn)生，從而調(diào)控造血細胞的增殖。本研究通過隨訪低危MDS患者的狀況，觀察到HO-1高表達組患者PFS長于HO-1低表達組患者。通過COX回歸分析觀察到HO-1的表達水平是判斷低危組MDS預后的獨立因素，提示HO-1是阻止病情進展的保護性因素。上調(diào)HO-1的表達可能會通過優(yōu)化造血細胞的增殖條件而減輕造血細胞的凋亡，從而改善MDS低?；颊叩念A后狀況。

基礎實驗證明HO-1可以調(diào)控MAPK信號通路中的JNK發(fā)揮細胞保護作用。Das等于2006年報道在大鼠心肌缺血再灌注模型中，HO-1通過環(huán)鳥苷酸依賴的蛋白激酶G(PKG)可激活JNK從而抑制心肌細胞壞死和凋亡，而應用JNK抑制劑可以阻斷HO-1對心肌細胞的保護作用，這說明HO-1可上調(diào)磷酸化JNK信號分子水平的表達。為了進一步探討HO-1對低危MDS患者預后的影響，我們給予不同濃度Hemin進行體外干預，發(fā)現(xiàn)隨著HO-1蛋白分子表達量的逐漸增加，磷酸化JNK信號分子表達水平也逐漸升高，提示HO-1可能通過調(diào)控JNK信號分子活性來調(diào)節(jié)造血細胞增殖與凋亡的過程。

Nagata于1998年提出JNK主要通過調(diào)節(jié)鐵代謝而影響血紅蛋白的合成。在骨髓細胞中JNK被激活后可進一步增強應激性轉(zhuǎn)錄因子c-Jun活性，后者可與鐵蛋白H基因的ARE區(qū)結(jié)合，增加鐵蛋白表達，維護細胞內(nèi)鐵平衡，促進血紅蛋白的穩(wěn)定而有效合成并誘導紅系造血祖細胞的分化。JNK還能通過促進紅系爆式集落形成單位(BFU-E)細胞增殖，使細胞周期由G0期過渡到G1期，該過程可能與JNK激活下游轉(zhuǎn)錄因子AP-1，誘導Cyclin D1基因的表達有關。Malcovati等[8]在臨床研究中發(fā)現(xiàn)低危MDS患者血紅蛋白水平與預后密切相關，中重度貧血患者中位生存期明顯低于輕度貧血患者，通過COX回歸分析證明血紅蛋白水平的降低是影響患者預后的危險因素。HO-1表達水平上調(diào)可激活JNK信號分子活性，從而進一步促進紅系造血而有助于改善低危MDS的不良預后。此外，JNK不僅促進紅系造血，在骨髓粒系造血細胞中，還可通過磷酸化激活CCAAT/增強子結(jié)合蛋白α(C/EBPα)轉(zhuǎn)錄因子的活性，后者可能通過上調(diào)重組人粒細胞集落刺激因子(G-CSF)受體表達促進粒系祖細胞分化成熟。

HO-1作為一種保護性因子，其對低危MDS患者PFS的延長作用可能與激活JNK信號分子活動而改善MDS無效造血有關。Hemin是HO-1誘導劑，在低危MDS中，Hemin可有效上調(diào)HO-1的表達，具有濃度梯度依賴性，Hemin能否作為新的MDS靶向治療藥物有待于進一步探討。綜上所述，HO-1為改善低危組MDS患者預后以及延長患者生存期提供了一個新的研究方向，而且為呈高度異質(zhì)性的MDS患者個體化治療提供了有力依據(jù)。

[1] de Souza GF, Barbosa MC, Santos TE,et al. Increased parameters of oxidative stress and its relation to transfusion iron overload in patients with myelodysplastic syndromes. J Clin Pathol, 2013,66:996-998.

[2] Song YJ, Zong ZM, Liu HZ, et al. Heme oxygenase-1 regulates the JNK signaling pathway through the MLK3-MKK7-JNK3 signaling module in brain ischemia injury. Brain Res, 2012, 1429:1-8.

[3] Arruda MA, Rossi AG, de Freitas MS, et al. Heme inhibits human neutrophil apoptosis: involvement of phosphoinositide 3-kinases, MAPK, and NF-kappaB. J Immunol, 2004, 173:2023-2030.

[4] Vardiman JW, Thiele J, Arber DA, et al. The 2008 revision of the World Health Organization (WHO) classification of myeloid neoplasms and acute leukemia: Rationale and important changes. Blood, 2009, 114: 937-951.

[5] Orifassa CS, Camara NO. Cytoprotective role of heme oxygenase-1 and heme degradation derived end products in liver injury. World J Hepatol, 2013, 5:541-549.

[6] Wu ML, Ho YC, Yet SF. A central role of heme oxygenase-1 in cardiovascular protection. Antioxid Redox Signal, 2011, 15:1835-1846.

[7] Cao YA, Kusy S, Luong R, et al. Heme oxygenase-1 deletion affects stress erythropoiesis. PLoS One, 2011, 6:e20634.

[8] Malcovati L, Della Porta MG, Strupp C, et al. Impact of the degree of anemia on the outcome of patients with myelodysplastic syndrome and its integration into the WHO classification-based prognostic scoring system (WPSS). Haematologica, 2011, 96:1433-1440.