車杭盈

南平市第二醫(yī)院腫瘤內科，福建南平 354200

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，目前手術治療仍是最有效的治療手段，但大多數(shù)患者就診時已處晚期，失去手術治療機會，嚴重威脅人類健康。白花蛇舌草(Hedyotis diffusa，HD)系茜草科草本植物白花蛇舌草的全草，其味甘、淡，性涼，入心、肝、脾三經，具消腫、鎮(zhèn)痛及解毒的功效。近來研究[1]表明，白花蛇舌草具有顯著抗腫瘤活性，對肝癌、 結腸癌、白血病、 腦部腫瘤和前列腺癌等多種惡性腫瘤細胞均有明顯的抑制作用，但與肺癌相關的研究鮮見報道。本研究選用非小細胞肺癌A549細胞株作為研究對象，以不同藥物濃度白花蛇舌草注射液(Hedyotic diffusa willd injection，HDI)作用于A549細胞，觀察其對細胞增殖及凋亡的影響，并探討其對肺癌細胞的潛在抗腫瘤機制，為將來臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物

HDI購自吉林省通化振國藥業(yè)有限公司。臨用前用RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋到終濃度。

1.2 試劑與儀器

CCK-8試劑盒購自日本Dojindo公司。Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自奧地利Bender Medsystems公司。Bcl-2、survivin、β-actin抗體購自美國Cell Signaling公司。RPMI-1640培養(yǎng)液、 胎牛血清均源于美國 Gibco BRL公司。熒光倒置顯微鏡為日本Olympus公司產品。電泳槽、半干轉膜儀為美國 Bio-Rad公司產品。

1.3 細胞培養(yǎng)

非小細胞肺癌A549細胞株購自ATCC。置于 37 ℃、5%CO2飽和濕度條件的培養(yǎng)箱內進行培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含10% FBS的雙抗(100 IU青霉素和100 μg/ml鏈霉素)RPMI-1640培養(yǎng)液。每天更換培養(yǎng)液1次。

1.4 CCK-8法檢測細胞增殖

細胞按1×105/ml接種于 96孔培養(yǎng)板。設3個HDI組及1個對照組，每組細胞分別加入不同濃度HDI(20、40、80 ml/L)后繼續(xù)培養(yǎng)72 h。每孔加入10 μl WST-8，37 ℃孵育3 h。在酶聯(lián)免疫檢測儀OD為450 nm處測量各孔的吸光度值。計算細胞存活率，本實驗重復3次。

1.5 流式細胞術與Annexin V/PI雙染檢測細胞凋亡

細胞培養(yǎng)分組同上所述，具體步驟如下：懸浮細胞離心(2 000 r/min離心5 min)收集，貼壁細胞用不含EDTA的胰酶消化收集，用PBS洗滌細胞2次(2 000 rpm離心5 min)收集1～5×105細胞，加入500 μl的Binding Buffer懸浮細胞，加入5 μl Annexin V-FITC混勻后，加入5 μl PI，混勻；室溫、避光、反應5～15 min；在30 min內上流式細胞儀檢測。Cell Quest軟件分析，本實驗重復3次。

1.6 Western blot

收集細胞，用組織裂解液裂解并勻漿，然后以12 000 r/min離心15 min，取上清，用考馬斯亮藍法測定蛋白濃度，然后-80 ℃保存。取各組等量蛋白樣品50 μg，以10%的十二烷基磷酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，濕轉法使蛋白轉移至PVDF膜上，再用5%的脫脂奶粉的TBST室溫封閉2 h，后加入封閉液稀釋的抗Bcl-2抗體、抗survivin抗體、抗β-actin抗體，4 ℃過夜，洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫輕搖2 h，洗膜后用ECL顯影曝光，應用光密度掃描儀掃描各條帶密度。用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析。以靶蛋白與相應β-actin的密度積分比值表示靶蛋白表達水平高低，結果以實驗組/對照組密度表示。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 不同濃度HDI對A549細胞增殖的影響

不同濃度(20、40、80 ml/L)HDI作用72 h，細胞增殖明顯被抑制(P<0.05，P<0.01)，且隨著藥物濃度逐漸增加，細胞存活率逐漸下降，表明HDI能明顯抑制細胞增殖，這種抑制作用具有劑量依賴性。見圖1。

與對照組比較*P<0.05，**P<0.01圖1 不同濃度HDI對A549細胞增殖的影響

2.2 不同濃度HDI對A549細胞凋亡的影響

不同濃度(20、40、80 ml/L)HDI作用后，A549細胞凋亡顯著增加(P<0.05，P<0.01)，這種促凋亡作用具有劑量依賴性。見圖2。

2.3 不同濃度HDI對Bcl-2、survivin蛋白表達的影響

與對照組比較，不同濃度(40、80 ml/L)HDI組A549細胞Bcl-2和survivin蛋白的表達顯著下降(P<0.05，P<0.01)。見圖3。

3 討論

在惡性腫瘤的形成過程中，細胞凋亡相關基因的表達扮演重要角色，凋亡相關基因的突變、缺失或過度表達，可引起細胞凋亡障礙或相對無限增殖，導致腫瘤的發(fā)生發(fā)展，并對化療藥物產生耐藥性。因此，如何有效調控凋亡相關基因或其產物的表達，促進腫瘤細胞凋亡，增強腫瘤對藥物的敏感性是提高腫瘤治療有效率的關鍵所在?；熢诜切〖毎伟┲委熤姓紦?jù)重要的地位，但多藥耐藥性和藥物不良反應較為普遍，影響其療效。中藥不僅能有效抑制腫瘤生長，不容易產生耐藥性，而且對機體的損傷和毒副作用相對輕，因而研究中藥抗腫瘤作用及其分子機制原理是腫瘤治療領域的重要課題之一。許多研究[2-4]表明，白花蛇舌草在體外對多種腫瘤細胞生長具有抑制作用，腫瘤抑制作用是當前白花蛇舌草藥理活性的研究熱點，但在非小細胞肺癌治療的研究方面尚未見報道。Bcl-2、survivin是目前研究較為深入的凋亡調控相關基因，它們是在細胞凋亡過程當中發(fā)揮重要作用的調節(jié)蛋白，可抑制細胞凋亡而導致腫瘤發(fā)生發(fā)展。

與對照組比較*P<0.05，**P<0.01

與對照組比較*P<0.05，**P<0.01

本研究觀察了HDI對人非小細胞肺癌A549細胞增殖和凋亡的影響。結果表明，HDI可顯著抑制A549 細胞的增殖并促進A549 細胞凋亡，且隨著藥物濃度的增加，這種作用越明顯。為了進一步研究HDI促A549 細胞凋亡的機制，本實驗采用Western blot檢測HDI作用后A549細胞中Bcl-2、survivin表達水平的變化。結果顯示，HDI顯著抑制A549 細胞中凋亡相關蛋白Bcl-2與survivin的表達，表明HDI對A549細胞的凋亡誘導作用與Bcl-2和survivin的表達下調有關。因此，筆者認為Bcl-2和survivin表達降低是HDI促進A549細胞凋亡的可能分子機制之一。

[1] ANJUM R，KHAR A.Differential regulation of apoptosis in AK-5 tumor cells by the protooncogene Bcl-2：presence of Bcl-2 dependent and independent pathways[J].FEBS Lett，2001，499(1-2)：166-170.

[2] YU J，ZHANG L.Apoptosis in human cancer cells[J].Curr Opin Oncol，2009，16(1)：19-24.

[3] HAEBERLEIN SL.Mitochondrial function in apoptotic neuronal cell death[J].Neurochem Res，2004，29(3)：521-530.

[4] WU C，F(xiàn)UJIHARA H，YAO J，et al.Different expression patterns of Bcl-2，Bcl-xl，and Bax proteins after sublethal forebrain ischemia in C57Black /Crj6 mouse striatum[J].Stroke，2003，34(7)：1803-1808.