吳瓊，王二飛，吳軍軍

（湖北大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，湖北 武漢430062）

0 引言

從分子水平闡述蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子與具有生物活性的小分子間的相互作用特征是涉及化學(xué)、藥學(xué)、生命科學(xué)等學(xué)科的交叉課題，人們一直嘗試用各種物理和化學(xué)方法來獲取這方面的信息，以探討生命過程的規(guī)律.目前，在研究藥物小分子與生物大分子相互作用的各種方法中，光譜方法，尤其是熒光光譜和紫外光譜等方法因其靈敏度高、選擇性強(qiáng)、樣品用量少、操作方法簡便以及能提供較多的物理參數(shù)等優(yōu)點而得到了廣泛的應(yīng)用［1］.此外，圓二色譜法也成為分析蛋白質(zhì)構(gòu)象變化等方面的常用手段.

血清白蛋白（serum albumin）是血漿中含量最豐富的載體蛋白，可與許多內(nèi)源性或外源性化合物結(jié)合［2-3］.藥物進(jìn)入體內(nèi)后，要通過血漿的貯存與運輸，達(dá)到受體部位，進(jìn)而發(fā)生藥理作用.因此，蛋白質(zhì)與藥物的相互作用不僅影響藥物在體內(nèi)的吸收、分布，而且還影響藥物在體內(nèi)的代謝與排泄方式等.咖啡因是重要的天然甲基黃嘌呤類生物堿，它具有興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心臟、舒張血管、松弛平滑肌和利尿等重要的藥理功能，在臨床上的應(yīng)用十分廣泛［4-6］.本文中主要利用熒光光譜、紫外光譜和圓二色譜等光譜學(xué)方法，研究在近似生理條件下咖啡因與血清白蛋白的相互作用，從分子水平探討其作用機(jī)制、作用模式以及藥物在血清白蛋白上的作用位置等.由于咖啡因在熒光激發(fā)波長處有吸收，其猝滅行為中包含有“內(nèi)濾光效應(yīng)”［7］，因此我們對熒光實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行了校正，分析了“內(nèi)濾光效應(yīng)”對咖啡因與血清白蛋白結(jié)合常數(shù)的影響.另外，還通過紫外光譜和圓二色譜考察了咖啡因?qū)ρ灏椎鞍锥壗Y(jié)構(gòu)的影響.

1 實驗部分

1.1 試劑及溶液 咖啡因（上海第二試劑廠），牛血清白蛋白（BSA）和人血清白蛋白（HSA）（Sigma），華法林（江蘇醫(yī)藥有限公司），布洛芬（湖北百科藥業(yè)股份有限公司）.實驗試劑均為分析純，實驗用水為二次超純水.所有溶液均用pH＝7.4的PBS緩沖溶液或乙醇配制.

1.2 熒光光譜 用帶恒溫系統(tǒng)的F-2500熒光光度計（Hitachi，Japan），測定研究體系溶液在不同溫度（298，304，310K）的熒光發(fā)射譜，以（λex＝290nm，選定激發(fā)和發(fā)射狹縫均為2.5nm（BSA）及5.0nm（HSA）.

1.3 吸收光譜 TU-1901紫外-可見光譜儀（北京普析分析儀器公司），波長范圍450～190nm.

1.4 圓二色譜 測定室溫下各不同體系溶液的遠(yuǎn)紫外（200～260nm）圓二色譜.Jasco J-810圓二色譜儀（Jasco，Tokyo，Japan），0.1cm石英樣品池，掃描速度500nm／min，每個樣品均掃描3次.

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光猝滅機(jī)理和結(jié)合常數(shù) 熒光是高能級軌道的電子返回到低能級軌道時發(fā)射光子的過程.很多種分子的相互作用都能引起熒光體的熒光猝滅，如激發(fā)態(tài)反應(yīng)，能量轉(zhuǎn)移，基態(tài)復(fù)合物的形成以及碰撞猝滅.

蛋白質(zhì)的熒光主要來自色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等能產(chǎn)生熒光的氨基酸基團(tuán)，這3種氨基酸的熒光強(qiáng)度比大約為100∶9∶0.5［8］，因此通常情況下可以認(rèn)為蛋白質(zhì)的熒光主要來自色氨酸殘基的貢獻(xiàn).為了使血清白蛋白的熒光來自色氨酸殘基的貢獻(xiàn)而酪氨酸的影響降至最低，本文中以290nm為激發(fā)波長，通過檢測加入藥物前后血清白蛋白的內(nèi)源熒光變化情況來表征藥物與蛋白質(zhì)的結(jié)合關(guān)系.

利用血清白蛋白分子中色氨酸殘基的內(nèi)源熒光，以λex＝290nm激發(fā)，在340nm附近有很強(qiáng)的熒光峰；而以同樣激發(fā)波長激發(fā)咖啡因溶液時，在340nm附近則沒有熒光峰，表明咖啡因不會產(chǎn)生與血清白蛋白相互干擾的熒光.固定血清白蛋白的濃度為2.0×10-6mol·L-1，隨著體系中咖啡因濃度的增加，血清白蛋白的內(nèi)源熒光產(chǎn)生有規(guī)律的猝滅（圖1）.

熒光猝滅過程分為動態(tài)猝滅、靜態(tài)猝滅、混合猝滅等等，為了研究和討論的方便，通常將其分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅來討論.無論是動態(tài)猝滅還是靜態(tài)猝滅，其過程均遵循Stern-Volmer方程［9］：

式中F0和F分別表示不存在和存在猝滅劑時熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度，［Q］為猝滅劑的濃度，KSV是Stern-Volmer猝滅常數(shù).

圖1 咖啡因濃度對血清白蛋白熒光發(fā)射光譜的影響

由于動態(tài)猝滅依賴于擴(kuò)散，溫度升高時溶液的黏度下降，分子的運動加速，其結(jié)果會導(dǎo)致擴(kuò)散系數(shù)增大，從而增大猝滅常數(shù).若是靜態(tài)猝滅，溫度升高可能導(dǎo)致基態(tài)配合物穩(wěn)定性下降，從而減小猝滅常數(shù)［9］.因此可以根據(jù)不同溫度下血清白蛋白的熒光猝滅情況來區(qū)分猝滅類型.為了研究咖啡因?qū)ρ灏椎鞍椎拟鐧C(jī)理，我們考察了不同溫度（T＝298、304、310K）條件下，咖啡因?qū)ρ灏椎鞍椎臒晒忖缜闆r.以F0／F對相應(yīng)的［Q］作圖，由直線斜率可求得各自溫度下的KSV值（表1）.表1數(shù)據(jù)顯示，隨著溫度的升高，咖啡因-BSA體系的猝滅常數(shù)減小，咖啡因-HSA體系的猝滅常數(shù)則增大，表明咖啡因?qū)SA的熒光猝滅機(jī)理為靜態(tài)猝滅，而對HSA的熒光猝滅機(jī)理為動態(tài)猝滅.

表1 不同溫度下咖啡因與血清白蛋白作用的Stern-Volmer猝滅常數(shù)

對于靜態(tài)猝滅，其熒光猝滅數(shù)據(jù)可用修正的Stern-Volmer方程進(jìn)行處理［10］：

式中ΔF為加入猝滅劑前后熒光強(qiáng)度的變化，fa為蛋白質(zhì)（熒光基團(tuán)）可接近猝滅劑的分?jǐn)?shù)，Ka為有效猝滅常數(shù)，可用作結(jié)合常數(shù).以F0／ΔF對1／［Q］作圖，即可求得蛋白質(zhì)與咖啡因的結(jié)合常數(shù)Ka，列于表2.

表2 咖啡因與BSA作用的結(jié)合常數(shù)及熱力學(xué)參數(shù)

假設(shè)生物大分子的若干個結(jié)合位點是獨立且相同的，根據(jù)小分子與大分子配位方程［11］：

式中Kb與n分別是表觀結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點數(shù).根據(jù)（3）式，以lg（（F0-F）／F）對lg［Q］作圖，由直線斜率和截距即可求出咖啡因與HSA的表觀結(jié)合常數(shù)Kb及結(jié)合位點數(shù)n，具體結(jié)果列于表3.結(jié)果顯示Kb及n隨體系溫度升高而減小，表明咖啡因-HSA體系間形成的結(jié)合物不穩(wěn)定，溫度升高時發(fā)生了部分分解［11］.

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)決定其性質(zhì)與功能.HSA由585個氨基酸殘基組成，僅在214位有一個色氨酸殘基（Trp214）.BSA由582個氨基酸殘基組成，其氨基酸序列與HSA非常類似，但與HSA不同的是，BSA在134及212位上各有一個色氨酸殘基（Trp134，Trp212）［12］，Trp212位于蛋白質(zhì)疏水腔內(nèi)而Trp134則位于分子表面，因此兩者的光譜性質(zhì)會略有差別.可能是134位的色氨酸殘基直接與咖啡因的極性基團(tuán)作用而導(dǎo)致了兩種蛋白質(zhì)猝滅機(jī)理的不同，而更詳細(xì)的關(guān)于兩者猝滅機(jī)理的差別還有待進(jìn)一步研究.

表3 咖啡因與HSA作用的表觀結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點數(shù)及熱力學(xué)參數(shù)

2.2 結(jié)合模式 藥物小分子與蛋白質(zhì)等生物大分子之間的相互作用通常包括靜電作用力、疏水作用力、氫鍵、范德華力和空間位阻排斥力等［13］，根據(jù)相互作用的熱力學(xué)參數(shù)，可以近似判斷活性小分子與生物大分子之間的主要作用力類型.若在研究的溫度范圍內(nèi)，反應(yīng)的焓變沒有明顯變化，視為常數(shù)，利用van’t Hoff方程可以計算反應(yīng)的焓變ΔH和熵變ΔS：

式中K為對應(yīng)溫度下的結(jié)合常數(shù)，R為摩爾氣體常數(shù).以1nK對1／T作圖，由斜率與截距可以分別計算出焓變ΔH和熵變ΔS，再由下式計算出反應(yīng)的自由能變：

利用不同溫度下的Ka和Kb值根據(jù)（4）式作圖（圖2）并計算咖啡因與血清白蛋白作用的熱力學(xué)參數(shù)，結(jié)果分別列于表2和表3.

圖2 咖啡因與血清白蛋白作用的van’t Hoff關(guān)系圖pH＝7.4，c（serum albumin）＝2.0×10-6 mol·L-1

咖啡因與BSA和HSA作用的van’t Hoff關(guān)系圖線性關(guān)系良好，說明在實驗溫度范圍內(nèi)，ΔH幾乎保持常數(shù).根據(jù)表2和表3結(jié)果，ΔH和ΔS均小于0，由此可以推測，咖啡因與BSA和HSA之間的作用力主要是氫鍵和范德華力［14］，且ΔG＜0，說明咖啡因與血清白蛋白的結(jié)合是由焓驅(qū)動的自發(fā)過程，體系熵變小于零，對自發(fā)過程不利.

2.3 熒光光譜“內(nèi)濾光效應(yīng)”的校正 由于咖啡因在熒光激發(fā)波長（290nm）處有吸收，隨著樣品中咖啡因濃度的增加，其猝滅行為中包含有“內(nèi)濾光效應(yīng)”，根據(jù)下列方程我們對熒光實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行了校正［15］：

式中FC和F分別代表校正后和觀察到的熒光強(qiáng)度，OD290為咖啡因在290nm處的光密度.“內(nèi)濾光效應(yīng)”對血清白蛋白熒光光譜的影響見圖3.從圖中可知校正后BSA和HSA的最大熒光強(qiáng)度猝滅約15%，而如果不校正則約為25%.根據(jù)校正后的熒光強(qiáng)度計算的Stern-Volmer猝滅常數(shù)以及結(jié)合常數(shù)分別列于表4和表5，結(jié)果顯示KSV，Ka和Kb值均比未校正時減小.即由于咖啡因在熒光激發(fā)波長處有吸收，隨著咖啡因濃度的增加，對入射光的吸收作用也增大，相當(dāng)于降低了激發(fā)光的強(qiáng)度，從而使熒光強(qiáng)度下降，掩蓋了配體與蛋白質(zhì)結(jié)合的真實熒光猝滅情況.因此，為了深入研究藥物分子與血清白蛋白的相互作用，需要對“內(nèi)濾光效應(yīng)”進(jìn)行校正.

2.4 蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化 為了考察咖啡因?qū)ρ灏椎鞍锥壗Y(jié)構(gòu)的影響，我們測試了不同濃度咖啡因與血清白蛋白作用的UV-vis譜（圖4）.隨著咖啡因的加入和濃度的增加（圖中A→K），咖啡因-血清白蛋白體系的吸收光譜發(fā)生明顯變化，在300～250nm區(qū)域的吸收明顯增強(qiáng)并伴隨著最大吸收波長的藍(lán)移（BSA：276→273nm，HSA：279→272nm），表明隨著咖啡因的加入，血清白蛋白分子的肽鏈結(jié)構(gòu)有所伸展，色氨酸殘基所處微環(huán)境的極性增強(qiáng)，疏水性降低［16］.

圖3 咖啡因存在下血清白蛋白的熒光光譜（T＝298K）

表4 校正后咖啡因與血清白蛋白作用的Stern-Volmer猝滅常數(shù)

表5 校正后咖啡因與血清白蛋白作用的結(jié)合常數(shù)

圖4 咖啡因?qū)ρ灏椎鞍鬃贤馕展庾V的影響（T＝298K）

圓二色譜（circular dichroic，CD）在研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)方面具有獨特的優(yōu)勢，不僅可以為蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化提供相關(guān)信息，而且還可以定量推算出其分子中α-螺旋、β-折疊、以及無規(guī)則卷曲的含量等［17-18］.為了進(jìn)一步論證咖啡因?qū)ρ灏椎鞍锥壗Y(jié)構(gòu)的影響，我們測試了不同濃度咖啡因與血清白蛋白作用的CD譜（圖5）.與文獻(xiàn)報道一致，血清白蛋白的CD譜在208nm和222nm紫外區(qū)域出現(xiàn)兩個負(fù)峰，這是蛋白質(zhì)典型的α-螺旋的結(jié)構(gòu)特征［19］.

為了定量計算蛋白質(zhì)不同類型二級結(jié)構(gòu)的含量，我們將CD結(jié)果用含有43種已知精確二級結(jié)構(gòu)模型蛋白質(zhì)作為參考集的SELCON3計算程序進(jìn)行分析［20-21］，計算結(jié)果如表6所示.隨著咖啡因濃度的增加，α-螺旋含量降低（BSA：54.5%→48.7%，HSA：46.6%→36.0%），說明血清白蛋白分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，咖啡因與蛋白質(zhì)主要多肽鏈的氨基酸殘基結(jié)合，破壞了蛋白質(zhì)的氫鍵結(jié)構(gòu)［22］，蛋白質(zhì)則采取更松散的構(gòu)象狀態(tài)，導(dǎo)致疏水性降低.該分析結(jié)果與紫外光譜得出的結(jié)論非常一致.

圖5 咖啡因與血清白蛋白作用的圓二色譜c（serum albumin）＝2.0×10-6 mol·L-1；c（caffeine）／（10-6 mol·L-1），A～C：0，10.0，20.0，respectively

表6 由SELCON3確定的不同二級結(jié)構(gòu)的含量

2.5 咖啡因在BSA上的結(jié)合部位 根據(jù)小分子與大分子配位方程（3），求出咖啡因-BSA體系結(jié)合位點數(shù)n＝1.024.從表5可以看出咖啡因與BSA的結(jié)合常數(shù)較大，咖啡因與BSA作用的結(jié)合位點數(shù)約為1，表明它們之間可以形成一個強(qiáng)結(jié)合位點.

BSA和HSA的三維晶體結(jié)構(gòu)非常類似，有3個結(jié)構(gòu)域：SiteⅠ，SiteⅡ和SiteⅢ，其中每個結(jié)構(gòu)域分為A，B兩個亞結(jié)構(gòu)域，它們以槽口相對的方式形成圓筒狀結(jié)構(gòu)，幾乎所有疏水性氨基酸都包埋在圓筒腔內(nèi)部，形成疏水腔［23］.血清白蛋白的主要鍵合區(qū)域就位于SiteⅠ（Subdomain IIA）及SiteⅡ（SubdomainⅢA）.

為了確定咖啡因在BSA上的結(jié)合位置，實驗選擇華法林（Warfarin）和布洛芬（Ibuprofen）分別作為SiteⅠ和SiteⅡ位［24-25］的標(biāo)記物加入到咖啡因-BSA體系（圖6）.加入華法林后，BSA和咖啡因-BSA體系的熒光強(qiáng)度明顯降低，而加入布洛芬后體系的熒光強(qiáng)度幾乎沒有變化，說明華法林占據(jù)了部分與BSA結(jié)合的咖啡因的位置，華法林與咖啡因競爭同一個位點，即SiteⅠ（SubdomainⅡA）位.

圖6 位點標(biāo)記物對咖啡因-BSA體系的影響（T＝298K）

［1］Guo Q L，Li R，Jiang F L，et al.Characterization of the interactions between itraconazole and human and bovine serum albumins by a spectroscopic method［J］.Acta Phys-Chim Sin，2009，25（10）：2147-2154.

［2］Ran D H，Wu X，Zheng J H，et al.Study on the interaction between florasulam and bovine serum albumin［J］.J Fluoresc，2007，17：721-726.

［3］Cui F L，Wang J L，Cui Y R，et al.Fluorescent investigation of the interactions between N-（p-chlorophenyl）-N-（1-naphthyl）thiourea and serum albumin：synchronous fluorescence determination of serum albumin［J］.Anal Chim Acta，2006，571：175-183.

［4］Barone J J，Roberts H R.Caffeine consumption［J］.Food Chem Toxico，1996，34：119-129.

［5］Lieberman H R，Wurtman R J，Garfield G S，et al.The effects of low doses of caffeine on human performance and mood［J］.Psychopharmacology，1987，92：308-312.

［6］Jarvis M J.Does caffeine intake enhance absolute levels of cognitive performance？［J］.Psychopharmacology，1993，110：45-52.

［7］Gonzalez-Jimenez J，F(xiàn)rutos G，Cayre I.Fluorescence quenching of human serum albumin by xanthines［J］.Biochem Pharmacol，1992，44：824-826.

［8］Hu Y J，Liu Y，Zhao R M，et al.Spectroscopic studies on the interaction between methylene blue and bovin serum albumin［J］.J Photochem Photobiol A-Chem，2006，179：324-329.

［9］Lakowicz J R.Principles of fluorescence spectroscopy［M］.New York：Plenum Press，1999：237-265.

［10］Lehrer S S.The quenching of the tryptophyl fluorescence of model compounds and of lysozyme by iodide ion［J］.Biochemistry，1971，10：3254-3263.

［11］Tong J Q，Tian F F，Li Q，et al.Probing the adverse temperature dependence in the static fluorescence quenching of BSA induced by a novel anticancer hydrazone［J］.Photochem Photobiol Sci，2012，11：1868-1879.

［12］Kragh-Hansen U.Molecular aspects of ligand binding to serum albumin［J］.Pharmacol Rev，1981，33：17-53.

［13］Leckband D.Measuring the forces that control protein interactions［J］.Annu Rev Biophys Biomol Struct，2000，29：1-26.

［14］Ross P D，Subramanian S.Thermodynamics of protein association reactions：forces contributing to stability［J］.Biochemistry，1981，20：3096-3102.

［15］Anita Krisko，Marina Kveder，Slavko Pecar，et al.A study of caffeine binding to human serum albumin［J］.Croat Chem Acta，2005，78（1）：71-77.

［16］Hu Y J，Liu Y，Wang J B，et al.Study of the interaction between monoammonium glycyrrhizinate and bovine serum albumin［J］.J Pharm Biomed Anal，2004，36：915-919.

［17］Miles A J，Wallace B A.Synchrotron radiation circular dichroism spectroscopy of proteins and applications in structural and functional genomics［J］.Chem Soc Rev，2006，35：39-51.

［18］Dong A，Matsuura J，Allison S D，et al.Infrared and circular dichroism spectroscopic characterization of structural differences betweenβ-lactoglobulin A and B［J］.Biochemistry，1996，35：1450-1457.

［19］Kamat B P，Seetharamappa J.In vitro study on the interaction of mechanism of tricyclic compounds with bovine serum albumin［J］.J Pharm Biomed Anal，2004，35：655-664.

［20］Sreerama N，Woody R W.A self-consistent method for the analysis of protein secondary structure from circular dichroism［J］.Anal Biochem，1993，209：32-34.

［21］Whitmore L，Wallace B A.DICHROWEB，an online server for protein secondary structure analyses from circular dichroism spectroscopic data［J］.Nucleic Acids Res，2004，32：W668-W673.

［22］Cui F L，F(xiàn)an J，Li J P，et al.Interactions between 1-benzoyl-4-p-chlorophenyl thiosemicarbazide and serum albumin：investigation by fluorescence spectroscopy［J］.Bioorg Med Chem，2004，12：151-157.

［23］Carter D C，Ho J X.Structure of serum albumin［J］.Adv Protein Chem，1994，45：153-203.

［24］Sudlow G，Birkett D J，Wade D N.Characterization of two specific drug binding sites on human serum albumin［J］.Mol Pharmacol，1975，11：824-832.

［25］Sudlow G，Birkett D J，Wade D N.Further characterization of specific drug binding sites on human serum albumin［J］.Mol Pharmacol，1976，12：1052-1061.