趙文珠，居文政，孫冰婷，臧雨馨，談恒山(.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南京 20029； 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院臨床藥理科，南京 20029；.南京軍區(qū)總醫(yī)院，南京 20002)

具棲冬青苷和毛冬青酸是從毛冬青干燥根中提取出的活性成分[1]。毛冬青酸具有抗血栓作用，一方面能增加血漿優(yōu)球蛋白的溶解活性及血小板內(nèi)環(huán)腺苷酸的含量，另一方面能抑制由二磷酸腺苷和膠原誘導(dǎo)產(chǎn)生的血小板聚集。在臨床上，血小板聚集率升高、血液黏度增加均會(huì)加速冠心病的發(fā)生和發(fā)展[2]。此外，毛冬青酸不僅是毛冬青的主要成分，也是毛冬青皂苷類成分在體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物。藥物血漿蛋白結(jié)合率直接影響藥物進(jìn)入體內(nèi)后的分布、代謝及排泄速率，因此，其是與藥物藥效及藥理作用密切相關(guān)的一項(xiàng)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。因此，研究藥物血漿蛋白結(jié)合率具有重要意義。有關(guān)具棲冬青苷和毛冬青酸血漿蛋白結(jié)合率的研究，尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。文中以平衡透析法研究具棲冬青苷和毛冬青酸在大鼠體外血漿中的蛋白結(jié)合率，為毛冬青在臨床聯(lián)合用藥提供參考。

1 儀器與材料

1.1儀器 Agilent 1100，配脫氣機(jī)、G1311A四元泵、G1314A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱和G1314A檢測(cè)器，Chemstation色譜工作站；Micro-17R冷凍離心機(jī)(美國Thermo公司)；Mettler AE240電子天平(上海梅特勒-托利多有限公司)；Direct-Q5超純水機(jī)(法國Millipore公司)；WH-2微型旋渦混合儀(上海市滬西分析儀器廠)；透析袋(14000D，壓平寬度25 mm，美國聯(lián)合碳化)。

1.2試藥 具棲冬青苷(成都艾科達(dá)化學(xué)試劑有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%)；毛冬青酸(成都普菲德生物技術(shù)有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%)；肉桂酸(中國藥品生物制品檢定所，質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%)；甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純。

1.3動(dòng)物 SD大鼠，180～220 g，雌雄各半，由南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。合格證號(hào)：SCXK(蘇)2009-0001。

2 樣品檢測(cè)方法的考察

2.1對(duì)照品溶液的配制 精密稱取具棲冬青苷和毛冬青酸對(duì)照品適量，加甲醇定容，搖勻，分別制成每1 mL含具棲冬青苷3.08 mg、含毛冬青酸3.15 mg的對(duì)照品儲(chǔ)備液，備用。

2.2色譜條件 色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-1.0 mL·L-1磷酸(65∶35)；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：40 ℃；檢測(cè)波長：215 nm；進(jìn)樣量：20 μL。

2.3生物樣品(血漿或透析液)預(yù)處理 精密吸取100 μL血漿或透析液樣品，加入10 μL 3.776 mg·L-1肉桂酸溶液(內(nèi)標(biāo))，渦旋30 s，再加入800 μL乙酸乙酯，渦旋3 min，離心10 min(12 000 r·min-1)。取750 μL上清液，氮?dú)饬鞔蹈?40 ℃)。加體積分?jǐn)?shù)75%甲醇100 μL復(fù)溶，離心5 min(12 000 r·min-1)，取20 μL上清液，進(jìn)樣分析。

2.4方法的專屬性 在本色譜條件下，肉桂酸、具棲冬青苷和毛冬青酸的Rt分別為2.91，4.40和11.84 min，內(nèi)源性物質(zhì)及其他成分對(duì)測(cè)定無干擾，見圖 1。

圖1 HPLC圖

2.5線性關(guān)系

2.5.1血漿樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線 取適量具棲冬青苷、毛冬青酸儲(chǔ)備溶液，用體積分?jǐn)?shù)75%甲醇稀釋，配制成6個(gè)不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品混合溶液，取空白血漿6份，每份100 μL，分別加10 μL混合對(duì)照品溶液，按2.3項(xiàng)下的方法對(duì)樣品進(jìn)行處理，精密取20 μL進(jìn)樣。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、各成分峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程見表1。

2.5.2透析液樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線 按照血漿樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線中混合對(duì)照品溶液的配制方法，配制成6個(gè)不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，取空白緩沖液(pH7.4)6份，每份100 μL，分別加入10 μL混合對(duì)照品溶液，按2.3項(xiàng)下的方法對(duì)樣品進(jìn)行處理，精密取20 μL進(jìn)樣。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、各成分峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程見表1。

表1 具棲冬青苷和毛冬青酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.6精密度、準(zhǔn)確度、提取回收率 按2.5項(xiàng)中配制血漿樣品、透析液樣品的方法，配制高、中、低3種質(zhì)量濃度的質(zhì)控樣品。按照各樣品的處理方法進(jìn)行操作，考察其精密度和準(zhǔn)確度。

空白血漿和空白透析液各取100 μL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制備方法，配制成3種不同質(zhì)量濃度的血漿樣品和透析液樣品，分別含具棲冬青苷51.15，153.46和251.17 μg·L-1及毛冬青酸51.15，153.33和264.38 μg·L-1。按樣品處理項(xiàng)下進(jìn)行操作，精密取20 μL進(jìn)樣分析；另外各取10 μL 3個(gè)不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，分別加入10 μL肉桂酸溶液(內(nèi)標(biāo))，氮?dú)饬鞔蹈?40 ℃)，加體積分?jǐn)?shù)75%甲醇100 μL復(fù)溶，離心5 min(12 000 r·min-1)，取20 μL上清液，進(jìn)樣分析，計(jì)算提取回收率，結(jié)果見表 2。

表2 具棲冬青苷和毛冬青酸的準(zhǔn)確度、精密度和提取回收率

2.7穩(wěn)定性 2.5項(xiàng)下質(zhì)控樣品于室溫條件保存，分別在0，4，8，12和24 h取樣，同時(shí)取4 ℃冷藏保存0，1，2和3 d的質(zhì)控樣品，按各生物樣品處理方法進(jìn)行操作， HPLC分析其穩(wěn)定性。按當(dāng)日所得的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算，結(jié)果顯示，各個(gè)質(zhì)量濃度樣品RSD<4%，說明樣品于室溫保存24 h內(nèi)和4 ℃冷藏保存3 d均穩(wěn)定。

3 藥物血漿蛋白結(jié)合的實(shí)驗(yàn)方法與評(píng)價(jià)

3.1PBS溶液的配制[3]精密稱取K2HPO4·3H2O 18.37 g、KCl 11.18 g、KH2PO42.74 g，溶于1 L超純水，所得PBS溶液的pH為7.4。

3.2實(shí)驗(yàn)方法[4]取管狀透析袋，進(jìn)行預(yù)處理，然后用棉線結(jié)扎一端，精密移取大鼠空白血漿(眼眶取血)1 mL于袋內(nèi)，系牢另一端，袋內(nèi)始終保留一定空氣，透析袋懸浮于盛有10 mL PBS緩沖液的平底玻璃管中，PBS緩沖液中加入適量對(duì)照品，配制成3種不同質(zhì)量濃度的溶液，分別含具棲冬青苷、毛冬青酸，最后封口膜封緊瓶口，置于4 ℃冰箱中平衡。定時(shí)攪拌溶液，加速平衡。待溶液平衡72 h，精密移取血漿樣品、PBS緩沖液各100 μL，按照樣品處理項(xiàng)下操作，分別測(cè)定透析袋內(nèi)外具棲冬青苷和毛冬青酸的質(zhì)量濃度，計(jì)算血漿蛋白結(jié)合率。

3.3透析膜吸附考察 將透析袋內(nèi)、外分別加入空白PBS緩沖液1 mL( 設(shè)體積為V1)和已知藥物質(zhì)量濃度CA的PBS 緩沖液10 mL( 設(shè)體積為V2)， 待透析袋內(nèi)外游離型藥物質(zhì)量濃度相等即達(dá)到平衡狀態(tài)，測(cè)定此時(shí)透析袋外藥物濃度CE[5]，按下列公式計(jì)算透析膜對(duì)藥物的吸附率X(數(shù)據(jù)見表3)。由表3可知，透析膜對(duì)藥物有微量的吸附，且吸附作用與劑量無依賴性。

表3 具棲冬青苷和毛冬青酸對(duì)透析膜的吸附率

3.4平衡時(shí)間的考察 在透析袋內(nèi)以磷酸鹽緩沖液代替血漿，按3.2方法操作，分別于12，24，36，48和72 h取樣，測(cè)定透析袋內(nèi)外藥物濃度。結(jié)果見表 4，表明具棲冬青苷和毛冬青酸透析達(dá)到平衡時(shí)間約需72 h。

表4 具棲冬青苷和毛冬青酸在透析袋內(nèi)外達(dá)到平衡的時(shí)間

3.5血漿蛋白結(jié)合率 血漿蛋白結(jié)合率=(袋內(nèi)血漿中藥物的質(zhì)量濃度-袋外PBS溶液中藥物的質(zhì)量濃度)/袋內(nèi)血漿中藥物的質(zhì)量濃度×100%。采用上述公式，對(duì)具棲冬青苷、毛冬青酸血漿蛋白結(jié)合率進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果見表5。

表5 具棲冬青苷和毛冬青酸的大鼠血漿蛋白結(jié)合率

4 討論

研究藥物與血漿蛋白結(jié)合有各種實(shí)驗(yàn)方法，一般常用的有平衡透析法、超速離心法、超濾法和透析法等[6-7]，其中平衡透析法是一種最常用的經(jīng)典方法。本文采用平衡透析法測(cè)定具棲冬青苷和毛冬青酸在大鼠體外血漿中的蛋白結(jié)合率，方法簡(jiǎn)單易行。

實(shí)驗(yàn)依次考察了生物樣品中蛋白的去除方法，包括甲醇、乙腈沉淀法和乙酸乙酯萃取法，同時(shí)對(duì)乙酸乙酯的用量也進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，乙酸乙酯萃取時(shí)不僅干擾少，而且提取回收率比較高。此外，通過比較不同內(nèi)標(biāo)(替硝唑、人參皂苷Rb1、黃芪皂苷等)，發(fā)現(xiàn)同等實(shí)驗(yàn)條件下，肉桂酸靈敏度高、提取回收率高、穩(wěn)定。

采用平衡透析法時(shí)，一般可選擇37 ℃或4 ℃作為測(cè)定的平衡溫度。參考文獻(xiàn)[8]，實(shí)驗(yàn)選擇4 ℃為平衡溫度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，具棲冬青苷和毛冬青酸在大鼠體外血漿的蛋白結(jié)合率范圍是35%～65%，屬于中等結(jié)合型，且在實(shí)驗(yàn)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，蛋白結(jié)合率與PBS溶液中藥物質(zhì)量濃度無關(guān)。藥物進(jìn)入體內(nèi)后就會(huì)與血漿蛋白結(jié)合，不同的藥物結(jié)合率不同。血漿蛋白結(jié)合率越高的藥物，在臨床相互用藥時(shí)發(fā)生不良反應(yīng)的可能性就會(huì)越大。因此，研究藥物的蛋白結(jié)合率，對(duì)臨床聯(lián)合用藥具有重要意義。

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