劉懿萱，蔣京辰，葉春林(武警上海市總隊醫(yī)院，上海 201103)

白色假絲酵母菌(Candidaalbicans)又稱白色念珠菌，是臨床最常見的條件致病性真菌，廣泛存在于自然界，也存在于正常人口腔、上呼吸道、腸道及陰道等。隨著癌癥治療、器官移植、廣譜抗生素、免疫抑制劑和細(xì)胞毒性藥物的廣泛使用，深部真菌感染已經(jīng)發(fā)展成為免疫功能低下患者死亡的主要原因[1]。在深部真菌感染中，白色假絲酵母菌是最常見的病原菌，目前臨床用于治療白色假絲酵母菌感染的藥物主要為氟康唑、伊曲康唑、兩性霉素B、卡泊芬凈等。其中卡泊芬凈屬于棘白菌素類抗真菌藥物[2]，是一種β-( 1， 3)-葡聚糖合成酶的非競爭性抑制劑，目前臨床主要用于系統(tǒng)性治療侵襲性曲霉病和念珠菌病。然而臨床上真菌耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重，已成為臨床抗真菌治療失敗的主要原因[3]。因此，聯(lián)合用藥發(fā)揮協(xié)同作用、縮短療程、減少藥物毒副作用、擴大藥物抗菌譜、降低耐藥性，是目前深部真菌感染治療研究領(lǐng)域的一個重要研究方向[4]。氨基丁酸 (aminobutyric acid， GABA) 廣泛存在于自然界，是一種非蛋白質(zhì)組成的天然氨基酸，其具有較廣泛的生物學(xué)功能，如降血壓作用、鎮(zhèn)痛作用等[5]，暫未發(fā)現(xiàn)其抗真菌作用。GABA是機體本身所具有的活性物質(zhì)，作為一種新型的功能因子，愈來愈受到人們的關(guān)注，正成為醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域的一個熱點研究內(nèi)容[6]。此外，本院前期研究發(fā)現(xiàn)，包括氨基丁酸在內(nèi)的多種氨基酸聯(lián)合卡泊芬凈表現(xiàn)出協(xié)同關(guān)系(數(shù)據(jù)未發(fā)表)，故本實驗選取氨基丁酸作為主要研究對象。

本研究首次探討氨基丁酸的抗真菌活性，并將氨基丁酸與臨床上一種很有前途的系統(tǒng)性抗真菌藥物卡泊芬凈聯(lián)合應(yīng)用抗白色假絲酵母菌標(biāo)準(zhǔn)菌株SC5314，為臨床抗真菌感染提供新的治療方案。

1 儀器與材料

1.1儀器 THZ-82A臺式恒溫振蕩器(上海躍進醫(yī)療器械廠)；SW-CT-IF型單人雙面超凈化工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；Hitech-KFLow 超純水機(上海華耀貿(mào)易有限公司)；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(丹麥Nunclon公司產(chǎn)品)；Multiskan MK3型酶標(biāo)檢測儀(芬蘭Labsystems公司)。

1.2受試菌株 白色假絲酵母菌國際標(biāo)準(zhǔn)株SC5314由美國華盛頓喬治敦大學(xué)免疫微生物教研室William A.Fonzi教授惠贈，于沙堡葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(SDA)劃板活化[7]，30 ℃培養(yǎng)24～48 h后，于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3培養(yǎng)基 YNB培養(yǎng)液：YNB無氨基酵母氮源(Sigma公司) 6.7 g，葡萄糖 20 g，加去離子水定容至1 000 mL，0.45 μm微孔濾膜 過濾除菌，分裝后于4 ℃保存?zhèn)溆?；沙堡葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基(SDA)：蛋白胨10 g，葡萄糖40 g，瓊脂18 g，加去離子水900 mL溶解，加入2 μg·mL-1氯霉素水溶液50 mL，調(diào)整pH至7.0，定容至1 000 mL，高壓滅菌(121 ℃， 15 min)后于4 ℃保存?zhèn)溆?；YEPD培養(yǎng)液：酵母浸膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖 20 g，加去離子水900 mL溶解，定容至1 000 mL，高壓滅菌(121 ℃，15 min)后于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4試藥 氨基丁酸(GABA)和卡泊芬凈(CAS)均訂購于Sigma公司。氨基丁酸用DMSO(Sigma公司)溶解為0.2 mmol·L-1的藥物母液，-20℃儲存?zhèn)溆?。卡泊芬凈用DMSO溶解為2 μg·mL-1藥物母液，-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

2 方法

2.1藥物敏感性實驗 采用1997年臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(CLSI)公布的《酵母菌的液基稀釋法抗真菌藥物敏感實驗參考方案》[M2-A][8]。

2.1.1菌懸液制備 實驗前，用接種環(huán)從4 ℃保存的SDA培養(yǎng)基上挑取白色假絲酵母菌單克隆，接種至1 mL YEPD培養(yǎng)液中，于30 ℃以200 r·min-1振蕩培養(yǎng)，使其活化16 h，離心棄上清，稀釋相應(yīng)倍數(shù)后在顯微鏡下用血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)，以YNB培養(yǎng)液調(diào)整菌液濃度至1×103～5×103cells·mL-1。

2.1.2藥敏反應(yīng)板的制備和棋盤式微量稀釋法 取無菌96孔板，于每排1號孔加YNB液體培養(yǎng)基100 μL作空白對照；3～12號孔分別加入新鮮配制的菌液100 μL；2號孔分別加98 μL菌液和2 μL的藥物溶液；2～11號孔逐級倍比稀釋，12號孔不加藥物，只加入100 μL菌液作為陽性對照。合用的2種藥物于96孔板上以二維棋盤的縱(A至H)橫(2至11)2個方向分別進行2倍的倍比稀釋。氨基丁酸與卡泊芬凈合用后，使得卡泊芬凈的終質(zhì)量濃度為1，0.5，0.25，0.125，0.062 5，0.031 25，0.015 625，0.007 812 5，0.003 906 25和0.001 953 125 μg·mL-1，氨基丁酸的終濃度為20，10，5，2.5，1.25和0.625 μmol·L-1。

2.1.3最低抑菌濃度(MIC值)和聯(lián)合用藥效果評價 在30 ℃培養(yǎng)48 h后，啟用酶標(biāo)儀于發(fā)射波長630 nm，測定96個孔中白色假絲酵母菌的A值。與陽性對照孔相比，以A值下降80%以上的最低濃度孔中的藥物質(zhì)量濃度為MIC80(真菌生長80%被抑制時的最低藥物濃度)。部分抑菌濃度指數(shù) (fractional inhibitory concentration index， FICI)是評價聯(lián)合用藥的兩藥相互作用方式的主要參數(shù)。抑菌濃度分?jǐn)?shù)(FIC)分別為每一種藥物聯(lián)合抑菌時所需最低抑菌濃度(MIC)與單用時MIC的比值，而FIC指數(shù)(FICI)則等于2種藥物FIC之和。當(dāng)FICI≤0.5時，兩藥的相互作用確定為協(xié)同作用；0.54時兩藥產(chǎn)生拮抗作用[9]。

2.2抗真菌敏感性實驗 取該菌液至1 mL YNB培養(yǎng)液中，用上述方法再次活化16 h，離心棄上清，以YNB培養(yǎng)液調(diào)整菌液濃度至105個·mL-1。各試管藥物終質(zhì)量濃度為：卡泊芬凈0.012 5 μg·mL-1，卡泊芬凈0.012 5 μg·mL-1+氨基丁酸0.312 5 μmol·L-1，卡泊芬凈0.012 5 μg·mL-1+氨基丁酸0.625 μmol·L-1，卡泊芬凈0.012 5 μg·mL-1+氨基丁酸1.25 μmol·L-1，卡泊芬凈0.012 5 μg·mL-1+氨基丁酸2.5 μmol·L-1，卡泊芬凈0.012 5 μg·mL-1+氨基丁酸5 μmol·L-1，卡泊芬凈0.012 5 μg·mL-1+氨基丁酸10 μmol·L-1，卡泊芬凈0.012 5 μg·mL-1+氨基丁酸20 μmol·L-1，空白組不加藥物處理。在30 ℃培養(yǎng)箱中以200 r·min-1的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)16～24 h后，觀察各組試管渾濁情況。

2.3YNB培養(yǎng)液中生長曲線 取該菌液至YNB培養(yǎng)液中，以紫外分光光度計630 nm處測菌液A值，以YNB培養(yǎng)液稀釋并調(diào)整菌液濃度至A值為0.1。分別于100 mL上述菌液中加入氨基丁酸1.25 μmol·L-1、卡泊芬凈 0.012 5 μg·mL-1和氨基丁酸1.25 μmol·L-1+卡泊芬凈0.012 5 μg·mL-1，對照組加入相同體積的DMSO以消除差異，所有菌液中所含DMSO的量不高于0.5%。在30 ℃培養(yǎng)箱中以200 r·min-1的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)，分別在0，4，6，8，10，12和24 h從各個樣品中取出100 μL菌液，在紫外分光光度計630 nm波長處測量菌液的A值，來分析生長濃度的變化趨勢。

2.4統(tǒng)計學(xué)處理 所有實驗結(jié)果均來自至少3組平行或3次重復(fù)實驗，實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0分析軟件進行分析，組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，數(shù)據(jù)以*P<0.05表示。

3 實驗結(jié)果

3.1棋盤式微量稀釋法實驗結(jié)果 實驗結(jié)果顯示，單用氨基丁酸對SC5314的MIC80測定值>20 μmol·L-1，與卡泊芬凈聯(lián)合使用后，MIC80測定值降低了16倍，下降至1.25 μmol·L-1；并且聯(lián)合使用后卡泊芬凈的MIC80測定值由1.56×10-2μg·mL-1降至3.91×10-3μg·mL-1。依據(jù)以上數(shù)據(jù)，可以得出單用氨基丁酸的FIC值為0.065；單用卡泊芬凈的FIC值為0.25。所以兩藥合用的FIC指數(shù)(FICI)為0.3125(FICI<0.5)，說明氨基丁酸聯(lián)合卡泊芬凈表現(xiàn)出協(xié)同關(guān)系。

3.2抗真菌敏感性實驗結(jié)果 結(jié)果如圖1所示。在YNB培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h后，0.012 5 μg·mL-1卡泊芬凈單用組與空白組的渾濁程度沒有明顯差異；而0.012 5 μg·mL-1卡泊芬凈與0.312 5～0.625 μmol·L-1氨基丁酸合用后與空白組的渾濁程度沒有明顯差異；但0.012 5 μg·mL-1卡泊芬凈與1.25～20 μmol·L-1氨基丁酸合用后與空白組相比，可以直觀地觀察到試管內(nèi)渾濁程度明顯減弱。表明0.012 5 μg·mL-1卡泊芬凈聯(lián)合氨基丁酸體外對白色假絲酵母菌SC5314的抑制作用以1.25 μmol·L-1為界限，氨基丁酸濃度≥1.25 μmol·L-1時能抑制SC5314的生長。

圖1 氨基丁酸聯(lián)合卡泊芬凈抗白色假絲酵母菌敏感性實驗

3.3生長曲線實驗結(jié)果 結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，不加藥物的空白組與1.25 μmol·L-1氨基丁酸作用組和0.012 5 μg·mL-1卡泊芬凈作用組的生長曲線沒有顯著差異；但在1.25 μmol·L-1氨基丁酸和 0.012 5μg·mL-1卡泊芬凈合用后的生長情況差別很大：1.25 μmol·L-1氨基丁酸和 0.012 5 μg·mL-1卡泊芬凈合用8 h內(nèi)對白色假絲酵母菌標(biāo)準(zhǔn)菌株SC5314的生長曲線的抑制作用與其他3組沒有差別，10 h后生長抑制作用顯著強于其他3組。

圖2 氨基丁酸聯(lián)合卡泊芬凈抗白色假絲酵母菌生長曲線

4 討論

真菌的耐藥現(xiàn)象日趨嚴(yán)重，是臨床治療深部真菌感染失敗的重要原因[10]。聯(lián)合用藥是目前抗真菌藥的研究熱點之一，不僅能夠縮短治療周期、降低藥物毒副作用和劑量，而且還可擴大藥物抗菌譜、降低耐藥性。

卡泊芬凈具有廣泛的體外抗真菌活性， 尤其對曲霉和白色假絲酵母菌有很強的作用[11]。氨基丁酸(aminobutyric acid，GABA)是一種非蛋白質(zhì)組成的天然氨基酸，雖然暫時未發(fā)現(xiàn)其抗真菌作用，但其具有不良反應(yīng)小、來源廣、價格低廉等優(yōu)勢，是研究開發(fā)其作為抗真菌藥物尤其是聯(lián)合抗真菌藥物，具有良好的前景。氨基丁酸單用時MIC80測定值>20 μmol·L-1，與卡泊芬凈聯(lián)合使用后，MIC80測定值降低了16倍，下降至1.25 μmol·L-1；單用氨基丁酸的FIC值為0.065；單用卡泊芬凈的FIC值為0.25。所以兩藥合用的FIC指數(shù)(FICI)為0.312 5(FICI<0.5)，說明氨基丁酸聯(lián)合卡泊芬凈表現(xiàn)出協(xié)同關(guān)系。在抗真菌敏感性實驗中，0.012 5 μg·mL-1卡泊芬凈與空白組對比沒有顯著差異，但0.012 5 μg·mL-1的卡泊芬凈合用1.25 μmol·L-1氨基丁酸可以直觀地觀察到試管內(nèi)渾濁程度減弱，表明0.012 5 μg·mL-1卡泊芬凈聯(lián)合氨基丁酸體外對白色假絲酵母菌SC5314的抑制作用以1.25 μmol·L-1為界限，氨基丁酸濃度≥1.25 μmol·L-1時能抑制SC5314的生長。此外，在生長曲線實驗中，0.012 5 μg·mL-1卡泊芬凈合用1.25 μmol·L-1氨基丁酸后的生長曲線顯著(10，12和24 h 3個點的A值，3組之間進行P檢驗，P<0.05)低于同濃度下兩藥單用的生長曲線。由以上實驗結(jié)果可以看出，氨基丁酸本身沒有抗真菌活性，但與卡泊芬凈合用后有顯著的協(xié)同關(guān)系，抗真菌作用顯著增強。

本實驗首次發(fā)現(xiàn)氨基丁酸與卡泊芬凈合用后有顯著的協(xié)同關(guān)系，可為臨床用藥提供新的治療方案，可通過聯(lián)合用藥的方案來提高抗真菌藥物的治療效果，降低藥物的毒性。有關(guān)氨基丁酸協(xié)同卡泊芬凈抑制真菌的作用機制有待于進一步研究。

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