竇 勤，閆 明，彭曉明，斯拉甫·艾白，李建梅*( 1.新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所，烏魯木齊 830049；2.新疆維吾爾醫(yī)方劑學(xué)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830049)

白癜風(fēng)是一種臨床上常見的獲得性的色素脫失性皮膚病，發(fā)病率約為4%，病因尚不清楚，雖然白癜風(fēng)的治療藥物很多，但有效而不良反應(yīng)少的藥物仍然較少[1]。在維吾爾醫(yī)治療白癜風(fēng)的諸多方劑中，本文遴選出具有代表性的復(fù)方制劑驅(qū)白艾力勒思亞散，通過(guò)酶學(xué)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)篩選對(duì)小鼠B16細(xì)胞增殖、酪氨酸酶活性以及黑素生成的影響。酪氨酸酶活性是研究色素障礙性疾病的靶點(diǎn)[2-3]，維吾爾醫(yī)對(duì)白癜風(fēng)的治療積累了不少成功經(jīng)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)采用小鼠B16黑素瘤細(xì)胞為模型，研究驅(qū)白艾力勒思亞散乙醇提取物對(duì)小鼠B16細(xì)胞的細(xì)胞增殖活性、酪氨酸酶活性以及黑素生成量的影響，探討其治療白癜風(fēng)的作用機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1儀器 倒置顯微鏡(LaiKa公司)；自動(dòng)酶標(biāo)儀(MODEL550 BIO-RAD)。

1.2試藥 胎牛血清和RPMI1640培養(yǎng)基，均由美國(guó)Gibco公司提供；二甲基亞砜(DMSO)、聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)、 L-多巴、四甲基偶氮唑藍(lán) (MTT)，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；1640培養(yǎng)基(含2種抗生素：100 μg·mL-1鏈霉素、100 U·mL-1青霉素)。驅(qū)白艾力勒思亞散由新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所自制；選擇甲氧沙林(8-MOP)作為陽(yáng)性對(duì)照藥，該藥由重慶華邦制藥股份有限公司生產(chǎn)，實(shí)驗(yàn)時(shí)用二甲基亞砜溶解成低、中、高(10，50，100 μmol·L-1)3個(gè)濃度。

1.3細(xì)胞株 中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所提供(小鼠B16黑素瘤細(xì)胞株)。

2 方法

2.1乙醇提取物的制備 取適量驅(qū)白艾力勒思亞散在烘箱中適溫焙干后，粉碎過(guò)篩，稱取過(guò)篩后的粉末10 g，置于容器內(nèi)，加入100 mL體積分?jǐn)?shù)90%乙醇溶液，密封，均勻浸泡。2周后將濾液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮成稠膏至干，稱質(zhì)量后用二甲基亞砜溶液溶解成10 mg·mL-1的溶液。1640培養(yǎng)基稀釋后處理細(xì)胞，二甲基亞砜體積分?jǐn)?shù)低于0.2%[3]。

2.2小鼠B16黑素瘤細(xì)胞培養(yǎng) 1640培養(yǎng)基(含體積分?jǐn)?shù)10%小牛血清)在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2孵箱中常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)至融合狀態(tài)時(shí)，用胰蛋白酶(體積分?jǐn)?shù)0.25%)消化，每3天傳代1次[4]，每瓶約105個(gè)細(xì)胞傳代至25 cm2。

2.3細(xì)胞增殖活性測(cè)定(四甲基偶氮唑藍(lán)法)

2.3.1細(xì)胞接種 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞常規(guī)消化，取100 μL調(diào)整好的細(xì)胞液(5×104個(gè)·mL-1)，接種于96孔板，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)24 h，每孔加100 μL稀釋好的中藥復(fù)方，使藥物的質(zhì)量濃度為低、中、高(2，10，20 μg·mL-1)3個(gè)質(zhì)量濃度，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)立3個(gè)復(fù)孔。

2.3.2細(xì)胞增殖活性測(cè)定 設(shè)單純培養(yǎng)基組、中藥對(duì)照組(培養(yǎng)基+中藥組)和空白對(duì)照組(培養(yǎng)基+細(xì)胞組) 為對(duì)照組，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2孵箱中作用72 h，每孔加5 mg·mL-1四甲基偶氮唑藍(lán)溶液20 μL，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2孵箱中作用4 h，棄上清，每孔加二甲基亞砜溶液100 μL，其吸光度值用酶標(biāo)儀測(cè)定，用所測(cè)的吸光度值表示細(xì)胞增殖活性。

2.4黑素含量測(cè)定(氫氧化鈉裂解法) 細(xì)胞接種方法與對(duì)照設(shè)置同上所述，藥物作用72 h，棄上清液，用磷酸鹽緩沖液沖洗2次，加入氫氧化鈉(100 μmol·L-1)，水浴1 h(37 ℃)，其吸光度值在酶標(biāo)儀460 nm波長(zhǎng)處測(cè)定，用所測(cè)的吸光度值表示黑素生成量。

2.5酪氨酸酶活性的測(cè)定 細(xì)胞接種方法與對(duì)照設(shè)置同上所述，藥物作用72 h，棄上清液，用磷酸鹽緩沖液沖洗2次，每孔加入100 μL體積分?jǐn)?shù)1%聚乙二醇辛基苯基醚，震蕩5 min，置于-20 ℃1 h，隨室溫融化，使細(xì)胞完全裂解，每孔加入100 μL用磷酸鹽緩沖液配制的L-多巴液(體積分?jǐn)?shù)0.1%)，37 ℃孵育2 h，其吸光度值在酶標(biāo)儀460 nm波長(zhǎng)處測(cè)定，用所測(cè)吸光度值表示酪氨酸酶的活性。

3 結(jié)果

3.1小鼠B16黑素瘤細(xì)胞增殖活性測(cè)定 細(xì)胞增殖活性=實(shí)驗(yàn)組的吸光度值-中藥對(duì)照組的吸光度值，空白對(duì)照組細(xì)胞增殖活性=空白對(duì)照組的吸光度值-單純培養(yǎng)基對(duì)照組的吸光度值[5-6]。

驅(qū)白艾力勒思亞散乙醇提取物在中質(zhì)量濃度(10 μg·mL-1)有明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖作用(P<0.05)，高質(zhì)量濃度(20 μg·mL-1)有顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖作用(P<0.01)，8-MOP在中、高2個(gè)濃度(50和100 μmol·L-1)下對(duì)B16細(xì)胞增殖有顯著的促進(jìn)作用(P<0.05)。結(jié)果見表1。

表1 復(fù)方乙醇提取物對(duì)小鼠B16黑素瘤細(xì)胞增殖活性的影響

3.2黑素生成含量測(cè)定 黑素生成量=實(shí)驗(yàn)組的吸光度值-中藥對(duì)照組的吸光度值，空白對(duì)照組黑素生成量=空白對(duì)照組的吸光度值-單純培養(yǎng)基對(duì)照組的吸光度值[7]。

驅(qū)白艾力勒思亞散乙醇提取物在低、中質(zhì)量濃度(5和10 μg·mL-1)有明顯促進(jìn)細(xì)胞黑素生成作用(P<0.05)， 高質(zhì)量濃度(20 μg·mL-1)有顯著促進(jìn)細(xì)胞黑素生成作用(P<0.01)，8-MOP在低、中濃度(10和50 μmol·L-1)有明顯促進(jìn)細(xì)胞黑素生成作用(P<0.05)， 高質(zhì)量濃度(100 μmol·L-1)有顯著促進(jìn)細(xì)胞黑素生成作用(P<0.01)。結(jié)果見表2。

表2 復(fù)方乙醇提取物對(duì)小鼠B16黑素瘤細(xì)胞黑素生成量的影響

3.3酪氨酸酶活性測(cè)定 酪氨酸酶活性=實(shí)驗(yàn)組的吸光度值-中藥對(duì)照組的吸光度值，空白對(duì)照組酪氨酸酶活性=空白對(duì)照組的吸光度值-單純培養(yǎng)基對(duì)照組的吸光度值[8]。

驅(qū)白艾力勒思亞散乙醇提取物在中質(zhì)量濃度(10 μg·mL-1)有明顯促進(jìn)細(xì)胞黑素合成作用(P<0.05)，高質(zhì)量濃度(20 μg·mL-1)有顯著促進(jìn)細(xì)胞黑素合成作用(P<0.01)，8-MOP在中、高濃度(50和100 μmol·L-1)有明顯促進(jìn)細(xì)胞黑素合成作用(P<0.05)。見表3。

表3 復(fù)方乙醇提取物對(duì)小鼠B16黑素瘤細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響

4 討論

驅(qū)白艾力勒思亞散是由維藥西青果、余甘子、訶子肉、黑種草子、巴旦仁組成的復(fù)方制劑，是維吾爾醫(yī)治療白癜風(fēng)的經(jīng)典劑型[9]。

本實(shí)驗(yàn)采用一般中藥實(shí)驗(yàn)研究常用的醇提方法，研究驅(qū)白艾力勒思亞散對(duì)細(xì)胞的酪氨酸酶、小鼠B16黑素瘤細(xì)胞的增殖、黑素生成的影響，酪氨酸酶是黑素合成的關(guān)鍵限速酶[10-11]，以酪氨酸酶的活性為靶點(diǎn)是研究白癜風(fēng)等色素障礙性疾病病因病理的關(guān)注點(diǎn)[12]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，驅(qū)白艾力勒思亞散乙醇提取物對(duì)小鼠B16黑素瘤細(xì)胞的增殖有明顯促進(jìn)作用，對(duì)黑素合成有顯著促進(jìn)作用，對(duì)細(xì)胞的酪氨酸酶活性有顯著的促進(jìn)作用，其中高濃度作用明顯，且各指標(biāo)的一致性較好，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，8-MOP對(duì)B16有一定激活作用。維吾爾醫(yī)治療白癜風(fēng)已積累了豐富的經(jīng)驗(yàn)， 但其確切作用機(jī)制至今仍不清楚，本實(shí)驗(yàn)為治療白癜風(fēng)等色素障礙性疾病藥物的細(xì)胞篩選奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 秦萬(wàn)章.皮膚病研究[M].上海：上?？萍汲霭嫔?，1990: 525-538.

[2] Tobin D J，Wanson N N, Pittelkow MR, et al. Melanoeytes arei1 absellf in lesional skin of long duzationvitiligo[J]. J Pathol，2000，191(4): 407-416.

[3] 鄧燕，楊柳.不同濃度的中藥刺蒺藜對(duì)黑素細(xì)胞和酪氨酸酶的作用[J].第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002，22(11): 1017-1019.

[4] Simth B，Selby P，Southgate J，et al．Detection of melanoma cells in peripheral blood by means of reverse transcriptase and polymerase chain reaction[J]．Lancet，1991，338(87): 1227-1229.

[5] 任燕冬，宋宏杉，陳巧云，等.杏仁油對(duì)黑色素瘤細(xì)胞B16細(xì)胞增殖及黑素合成的影響[J].中國(guó)醫(yī)藥科學(xué)，2011，1(9): 15-16.

[6] 尚靖，敖秉臣，劉文麗，等.七種增白中藥在體外對(duì)酪氨酸酶的影響[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，1995，30(11): 653-655.

[7] 劉之力，徐躍飛，涂彩霞，等.56味中藥乙醇提取物對(duì)酪氨酸酶活性影響的研究[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，22(10): 6-10.

[8] 程?hào)|慶，王遂泉，尉曉冬，等. 復(fù)方中藥對(duì)小鼠B16黑素瘤細(xì)胞株黑素合成和酪氨酸酶的激活作用[J].中華皮膚科雜志，2000，33(3): 173-174.

[9] 易沙克江·馬合穆德.中國(guó)醫(yī)學(xué)百科全書:維吾爾醫(yī)學(xué)[M].上海: 上海科學(xué)技術(shù)出版社，2005:137.

[10]劉棟，朱文元，譚城.皮質(zhì)類固醇對(duì)培養(yǎng)Cloudman S91黑素瘤細(xì)胞株黑素合成的影響[J].臨床皮膚科雜志，2003，32(1): 3-6.

[11]楊建華，周言，胡君萍，等.維藥沒食子對(duì)酪氨酸酶抑制作用的研究[J].西北藥學(xué)雜志，2014，29(1): 8-10.

[12]Matsuda H，Higashino M，Nakai Y，et al.Studies of cuticle drugs from natural sources. Inhibitory effects of arctostaphylos plants on melanin biosynthesis[J].Bio Pharm Bull，1996，19(1): 153-156.