錢智磊，張 亮，周秋云，陸 磊，丁紅梓，王 潔(南京市胸科醫(yī)院藥學(xué)部，南京 210029)

結(jié)核病(tuberculosis，TB)是嚴重危害人民群眾健康的呼吸系統(tǒng)傳染病，被列入我國法定重大傳染病。近20余年來，多耐藥結(jié)核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)及廣泛耐藥結(jié)核病(extensively drug-resistant tuberculosis，XDR-TB)的流行，使得包括我國在內(nèi)的各國抗癆事業(yè)再次面臨嚴峻的挑戰(zhàn)[1]。2011年，全球有63萬人被確診為MDR-TB，其中MDR-TB在初治及復(fù)治結(jié)核患者中的檢出率分別為3.7%和20%。我國是27個MDR-TB流行國家中最嚴重的國家之一。此外，有84個國家已發(fā)現(xiàn)XDR-TB，占MDR-TB病例的9%[2]。

異煙肼(isoniazid，INH)、利福平(rifampicin，RFP)、吡嗪酰胺(pyrazinamide，PZA)是用于結(jié)核病患者初始治療的基本藥物，大部分患者都可以得到良好的治療效果。然而，越來越多的患者(包括初治及復(fù)治)對以上藥物中的1種或多種耐藥，使得結(jié)核病的治療變得更加復(fù)雜，增加了病死率。WHO公布的耐藥結(jié)核病規(guī)劃管理指南(2011年版)指出，對于MDR-TB患者，推薦使用氟喹諾酮類和乙硫異煙胺[3]。目前，最有效的氟喹諾酮類藥物的活性由強至弱依次是:莫西沙星>左氧氟沙星>氧氟沙星，考慮到經(jīng)濟因素，以選擇左氧氟沙星(levofloxacin，LVFX)為宜。但是，臨床有報道，大約有2%～5%結(jié)核患者按標準治療方案和劑量給藥，療效仍然不理想甚至治療失敗，研究證實這些患者的血藥質(zhì)量濃度遠低于普通病例平均血藥質(zhì)量濃度[4-5]；同時，傳統(tǒng)的抗結(jié)核治療藥物易造成肝功能異常等不良反應(yīng)[6]，導(dǎo)致治療中斷，進而影響患者的治療。因此，臨床對于這些病例進行血藥質(zhì)量濃度治療監(jiān)測成為必要，通過血藥質(zhì)量濃度的監(jiān)測，可以較好地減少不良反應(yīng)的發(fā)生，保證療程的實施，提高治療效果。本研究團隊在長期進行結(jié)核病患者抗結(jié)核藥物血藥質(zhì)量濃度監(jiān)測的基礎(chǔ)上[7-9]，進一步建立了同時測定結(jié)核病患者血漿中異煙肼、吡嗪酰胺、利福平和左氧氟沙星的血藥質(zhì)量濃度的HPLC法，結(jié)果表明，本方法準確、快速、經(jīng)濟，適合臨床推廣。

1 儀器與試藥

1.1儀器 高效液相色譜系統(tǒng)(液相泵LC-20AB，PDA紫外檢測器SPD-M20A，島津，日本)；高速離心機(TG1650-WS，上海盧湘儀)；艾本德微量移液器(Eppendor，德國)；電子分析天平(EB224，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；渦旋儀(WH-2，上海滬西分析儀器有限公司)。

1.2試藥 異煙肼對照品(批號100578-200401)、吡嗪酰胺對照品(批號100178-200403)、利福平對照品(批號130496-200702)、左氧氟沙星對照品(批號130455-200202)，均為中國藥品生物制品檢定所提供；甲醇、乙腈(Merck公司，德國)均為色譜純；磷酸二氫鉀、三乙胺(國藥集團化學(xué)試劑有限公司，中國)均為分析純；水為自制純化水(Milli-Q Academic，MILLIPORE公司，美國)。

2 方法

2.1色譜條件 色譜柱：島津Inertsil ODS-SP(150 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：40 ℃；檢測波長：異煙肼261 nm、吡嗪酰胺268 nm、利福平340 nm、左氧氟沙星294 nm；流動相：A.甲醇，B.乙腈，C.0.05 mol·L-1KH2PO3水溶液(三乙胺調(diào)pH 6.0)，梯度條件(含次針預(yù)平衡時間)見表1；進樣量：20 μL。

表1 異煙肼、吡嗪酰胺、利福平和左氧氟沙星的HPLC梯度條件

2.2對照品溶液的配制 精密稱取一定量的各對照品，置于10 mL量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度分別為INH 1 000 μg·mL-1、PZA 1 000 μg·mL-1、RFP 1 000 μg·mL-1和LVFX 1 000 μg·mL-1的儲備液。儲備液于4 ℃冰箱保存。臨用前以甲醇稀釋成各種質(zhì)量濃度的對照品溶液。

2.3樣品處理方法 取血漿樣品300 μL，置于2 mL離心管中，加甲醇700 μL，旋渦混合1 min，以15 000 r·min-1離心10 min，取上清液20 μL進樣。

2.4方法專屬性實驗 按2.3項下操作，同法處理人空白血漿、對照品溶液加空白血漿和同時服用4種藥物患者血漿樣品。INH(通道一261 nm)、PZA(通道二268 nm)、 RFP(通道三340 nm)、LVFX(通道四294 nm)。

2.5標準曲線制備 取空白血漿8份，加入對照品儲備液使各對照品質(zhì)量濃度為0.2，0.4，0.8，1.6，3.2，6.4，12.8和25.6 μg·mL-1。按2.3項下操作，同法處理血漿進樣。以樣品質(zhì)量濃度為橫坐標、以對照品的峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，以樣品質(zhì)量濃度和峰面積進行回歸計算。

2.6精密度與回收率 精確配制低，中，高(0.75，7.5和15 μg·mL-1)的含4種藥物的血漿樣品，按2.3項下操作，同法處理血漿進樣。計算加樣回收率、日內(nèi)及日間精密度。

2.7重復(fù)性與穩(wěn)定性

2.7.1重復(fù)性實驗 取同一質(zhì)量濃度的儲備液，重復(fù)5次取樣制備供試品溶液，測定，計算標準偏差。

2.7.2穩(wěn)定性實驗 取低、中、高(0.75，7.5和15 μg·mL-1)的血漿對照品樣品，分別于0，1，2，4，8和12 h內(nèi)測定，計算標準偏差。

3 結(jié)果

3.1方法專屬性實驗結(jié)果 4種藥物分離的峰形良好，內(nèi)源性物質(zhì)無干擾，INH(通道一261 nm)、PZA(通道二268 nm)、RFP(通道三340 nm)、LVFX(通道四294 nm)的保留時間分別為4.7，5.6，12.6和13.9 min。見圖1。

3.2標準曲線與線性范圍結(jié)果 本方法線性關(guān)系良好，線性范圍可以基本包括結(jié)核病患者的血藥質(zhì)量濃度范圍。見表2。

表2 INF，PZA，RFP和LVFX的回歸方程與線性范圍

圖1 HPLC圖

3.3精密度與回收率結(jié)果 按2.6項下操作，各結(jié)果均符合規(guī)定。見表3。

表3 回收率與精密度測定結(jié)果

3.4重復(fù)性與穩(wěn)定性結(jié)果 按2.7項下操作，結(jié)果重復(fù)性RSD為1.72%，穩(wěn)定性RSD為1.69%，表明該方法的重復(fù)性及穩(wěn)定性良好。

3.5患者血藥質(zhì)量濃度 選取同時口服4種藥物5 d以上的患者5例，利福平0.45 g于早餐前30 min服用，異煙肼0.3 g和吡嗪酰胺0.5 g于餐后30 min服用，左氧氟沙星0.5 g于餐后60 min服用，用抗凝管采集病人服用異煙肼、吡嗪酰胺2 h后的靜脈血，以10 000 r·min-1離心10 min，分取血漿，置于離心管中，保存于低溫冰箱，備用。按 2.3項下操作，測定5名患者血藥質(zhì)量濃度，數(shù)據(jù)均在線性范圍內(nèi)，見表4。

表4 患者血藥質(zhì)量濃度測定結(jié)果

4 討論

本課題組比較了液液萃取法、甲醇沉淀吹干復(fù)溶法、固相萃取法和本方法采用的甲醇沉淀上清液直接進樣法，發(fā)現(xiàn)液-液萃取法的線性關(guān)系和精密度均不理想，而甲醇沉淀吹干復(fù)溶法需添加抗氧化劑，且耗時較長，不能滿足臨床報告需求。固相萃取法效果理想，但是成本較高，綜合成本超過物價局收費規(guī)定，不適合醫(yī)院常規(guī)開展檢測工作。相對而言，甲醇沉淀上清液直接進樣法減少了濃縮步驟；對方法靈敏度有影響，但是操作簡單，平行性好，所需時間及成本均較少，便于臨床開展。

目前報道的多組分抗結(jié)核藥物的同時測定往往應(yīng)用離子對試劑[10]，導(dǎo)致需要較長的柱平衡時間，且實驗重復(fù)性較差。同時，離子對試劑價格較高，且對色譜柱的損害較大，導(dǎo)致成本偏高，不適合醫(yī)院常規(guī)使用。本方法在流動相的選擇上避免了應(yīng)用離子對試劑，選擇了常規(guī)緩沖鹽體系，雖然在分離度方面略微低于離子對試劑，但仍然能夠達到專屬性實驗的要求，降低了檢測成本，有利于臨床工作的常規(guī)開展。

在前期研究中本課題組對不同固定相的色譜柱進行了篩選[9]，本次研究在此基礎(chǔ)上對色譜柱的柱長和填料粒徑進行了考察。發(fā)現(xiàn)250 mm的色譜柱相對于150 mm的色譜柱而言，可以略延長保留時間，增加分離度，但總體無顯著性差異，因此選擇150 mm色譜柱可以提高效率，較適合臨床常規(guī)檢測工作。填料粒徑3.5 μm的色譜柱與5 μm的色譜柱相比，可以增加分離度，改善峰形。但對于生物樣品來說，往往雜質(zhì)較多，且蛋白沉淀難以完全，易導(dǎo)致色譜柱污染，同時3.5 μm的色譜柱的價格遠遠高于5 μm的色譜柱，大大提高成本。綜合以上特點，本課題組選擇150 mm的填料粒徑5 μm的色譜柱進行實驗，為以后臨床常規(guī)檢測奠定基礎(chǔ)。

本方法在15 min內(nèi)可以完全出峰，考慮到生物藥品的復(fù)雜性，因此本課題組在15 min后加入一段較長時間的沖洗與次針預(yù)平衡時間，從而保證次針檢測的穩(wěn)定性與準確性。

通過血藥質(zhì)量濃度監(jiān)測，可以避免因個體差異導(dǎo)致的血藥質(zhì)量濃度過高所致的不良反應(yīng)，同時可以避免血藥質(zhì)量濃度過低導(dǎo)致的療效降低及耐藥性的產(chǎn)生。

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