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        HPLC法測定結(jié)核病患者血漿中異煙肼、吡嗪酰胺、利福平和左氧氟沙星的質(zhì)量濃度

        2014-08-20 08:39:32錢智磊周秋云丁紅梓南京市胸科醫(yī)院藥學(xué)部南京210029
        西北藥學(xué)雜志 2014年6期
        關(guān)鍵詞:吡嗪異煙肼氧氟沙星

        錢智磊,張 亮,周秋云,陸 磊,丁紅梓,王 潔(南京市胸科醫(yī)院藥學(xué)部,南京 210029)

        結(jié)核病(tuberculosis,TB)是嚴重危害人民群眾健康的呼吸系統(tǒng)傳染病,被列入我國法定重大傳染病。近20余年來,多耐藥結(jié)核病(multidrug-resistant tuberculosis,MDR-TB)及廣泛耐藥結(jié)核病(extensively drug-resistant tuberculosis,XDR-TB)的流行,使得包括我國在內(nèi)的各國抗癆事業(yè)再次面臨嚴峻的挑戰(zhàn)[1]。2011年,全球有63萬人被確診為MDR-TB,其中MDR-TB在初治及復(fù)治結(jié)核患者中的檢出率分別為3.7%和20%。我國是27個MDR-TB流行國家中最嚴重的國家之一。此外,有84個國家已發(fā)現(xiàn)XDR-TB,占MDR-TB病例的9%[2]。

        異煙肼(isoniazid,INH)、利福平(rifampicin,RFP)、吡嗪酰胺(pyrazinamide,PZA)是用于結(jié)核病患者初始治療的基本藥物,大部分患者都可以得到良好的治療效果。然而,越來越多的患者(包括初治及復(fù)治)對以上藥物中的1種或多種耐藥,使得結(jié)核病的治療變得更加復(fù)雜,增加了病死率。WHO公布的耐藥結(jié)核病規(guī)劃管理指南(2011年版)指出,對于MDR-TB患者,推薦使用氟喹諾酮類和乙硫異煙胺[3]。目前,最有效的氟喹諾酮類藥物的活性由強至弱依次是:莫西沙星>左氧氟沙星>氧氟沙星,考慮到經(jīng)濟因素,以選擇左氧氟沙星(levofloxacin,LVFX)為宜。但是,臨床有報道,大約有2%~5%結(jié)核患者按標準治療方案和劑量給藥,療效仍然不理想甚至治療失敗,研究證實這些患者的血藥質(zhì)量濃度遠低于普通病例平均血藥質(zhì)量濃度[4-5];同時,傳統(tǒng)的抗結(jié)核治療藥物易造成肝功能異常等不良反應(yīng)[6],導(dǎo)致治療中斷,進而影響患者的治療。因此,臨床對于這些病例進行血藥質(zhì)量濃度治療監(jiān)測成為必要,通過血藥質(zhì)量濃度的監(jiān)測,可以較好地減少不良反應(yīng)的發(fā)生,保證療程的實施,提高治療效果。本研究團隊在長期進行結(jié)核病患者抗結(jié)核藥物血藥質(zhì)量濃度監(jiān)測的基礎(chǔ)上[7-9],進一步建立了同時測定結(jié)核病患者血漿中異煙肼、吡嗪酰胺、利福平和左氧氟沙星的血藥質(zhì)量濃度的HPLC法,結(jié)果表明,本方法準確、快速、經(jīng)濟,適合臨床推廣。

        1 儀器與試藥

        1.1儀器 高效液相色譜系統(tǒng)(液相泵LC-20AB,PDA紫外檢測器SPD-M20A,島津,日本);高速離心機(TG1650-WS,上海盧湘儀);艾本德微量移液器(Eppendor,德國);電子分析天平(EB224,上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司);渦旋儀(WH-2,上海滬西分析儀器有限公司)。

        1.2試藥 異煙肼對照品(批號100578-200401)、吡嗪酰胺對照品(批號100178-200403)、利福平對照品(批號130496-200702)、左氧氟沙星對照品(批號130455-200202),均為中國藥品生物制品檢定所提供;甲醇、乙腈(Merck公司,德國)均為色譜純;磷酸二氫鉀、三乙胺(國藥集團化學(xué)試劑有限公司,中國)均為分析純;水為自制純化水(Milli-Q Academic,MILLIPORE公司,美國)。

        2 方法

        2.1色譜條件 色譜柱:島津Inertsil ODS-SP(150 mm×4.6 mm,5 μm);柱溫:40 ℃;檢測波長:異煙肼261 nm、吡嗪酰胺268 nm、利福平340 nm、左氧氟沙星294 nm;流動相:A.甲醇,B.乙腈,C.0.05 mol·L-1KH2PO3水溶液(三乙胺調(diào)pH 6.0),梯度條件(含次針預(yù)平衡時間)見表1;進樣量:20 μL。

        表1 異煙肼、吡嗪酰胺、利福平和左氧氟沙星的HPLC梯度條件

        2.2對照品溶液的配制 精密稱取一定量的各對照品,置于10 mL量瓶中,加入甲醇溶解并稀釋至刻度,制成質(zhì)量濃度分別為INH 1 000 μg·mL-1、PZA 1 000 μg·mL-1、RFP 1 000 μg·mL-1和LVFX 1 000 μg·mL-1的儲備液。儲備液于4 ℃冰箱保存。臨用前以甲醇稀釋成各種質(zhì)量濃度的對照品溶液。

        2.3樣品處理方法 取血漿樣品300 μL,置于2 mL離心管中,加甲醇700 μL,旋渦混合1 min,以15 000 r·min-1離心10 min,取上清液20 μL進樣。

        2.4方法專屬性實驗 按2.3項下操作,同法處理人空白血漿、對照品溶液加空白血漿和同時服用4種藥物患者血漿樣品。INH(通道一261 nm)、PZA(通道二268 nm)、 RFP(通道三340 nm)、LVFX(通道四294 nm)。

        2.5標準曲線制備 取空白血漿8份,加入對照品儲備液使各對照品質(zhì)量濃度為0.2,0.4,0.8,1.6,3.2,6.4,12.8和25.6 μg·mL-1。按2.3項下操作,同法處理血漿進樣。以樣品質(zhì)量濃度為橫坐標、以對照品的峰面積為縱坐標,繪制標準曲線,以樣品質(zhì)量濃度和峰面積進行回歸計算。

        2.6精密度與回收率 精確配制低,中,高(0.75,7.5和15 μg·mL-1)的含4種藥物的血漿樣品,按2.3項下操作,同法處理血漿進樣。計算加樣回收率、日內(nèi)及日間精密度。

        2.7重復(fù)性與穩(wěn)定性

        2.7.1重復(fù)性實驗 取同一質(zhì)量濃度的儲備液,重復(fù)5次取樣制備供試品溶液,測定,計算標準偏差。

        2.7.2穩(wěn)定性實驗 取低、中、高(0.75,7.5和15 μg·mL-1)的血漿對照品樣品,分別于0,1,2,4,8和12 h內(nèi)測定,計算標準偏差。

        3 結(jié)果

        3.1方法專屬性實驗結(jié)果 4種藥物分離的峰形良好,內(nèi)源性物質(zhì)無干擾,INH(通道一261 nm)、PZA(通道二268 nm)、RFP(通道三340 nm)、LVFX(通道四294 nm)的保留時間分別為4.7,5.6,12.6和13.9 min。見圖1。

        3.2標準曲線與線性范圍結(jié)果 本方法線性關(guān)系良好,線性范圍可以基本包括結(jié)核病患者的血藥質(zhì)量濃度范圍。見表2。

        表2 INF,PZA,RFP和LVFX的回歸方程與線性范圍

        圖1 HPLC圖

        3.3精密度與回收率結(jié)果 按2.6項下操作,各結(jié)果均符合規(guī)定。見表3。

        表3 回收率與精密度測定結(jié)果

        3.4重復(fù)性與穩(wěn)定性結(jié)果 按2.7項下操作,結(jié)果重復(fù)性RSD為1.72%,穩(wěn)定性RSD為1.69%,表明該方法的重復(fù)性及穩(wěn)定性良好。

        3.5患者血藥質(zhì)量濃度 選取同時口服4種藥物5 d以上的患者5例,利福平0.45 g于早餐前30 min服用,異煙肼0.3 g和吡嗪酰胺0.5 g于餐后30 min服用,左氧氟沙星0.5 g于餐后60 min服用,用抗凝管采集病人服用異煙肼、吡嗪酰胺2 h后的靜脈血,以10 000 r·min-1離心10 min,分取血漿,置于離心管中,保存于低溫冰箱,備用。按 2.3項下操作,測定5名患者血藥質(zhì)量濃度,數(shù)據(jù)均在線性范圍內(nèi),見表4。

        表4 患者血藥質(zhì)量濃度測定結(jié)果

        4 討論

        本課題組比較了液液萃取法、甲醇沉淀吹干復(fù)溶法、固相萃取法和本方法采用的甲醇沉淀上清液直接進樣法,發(fā)現(xiàn)液-液萃取法的線性關(guān)系和精密度均不理想,而甲醇沉淀吹干復(fù)溶法需添加抗氧化劑,且耗時較長,不能滿足臨床報告需求。固相萃取法效果理想,但是成本較高,綜合成本超過物價局收費規(guī)定,不適合醫(yī)院常規(guī)開展檢測工作。相對而言,甲醇沉淀上清液直接進樣法減少了濃縮步驟;對方法靈敏度有影響,但是操作簡單,平行性好,所需時間及成本均較少,便于臨床開展。

        目前報道的多組分抗結(jié)核藥物的同時測定往往應(yīng)用離子對試劑[10],導(dǎo)致需要較長的柱平衡時間,且實驗重復(fù)性較差。同時,離子對試劑價格較高,且對色譜柱的損害較大,導(dǎo)致成本偏高,不適合醫(yī)院常規(guī)使用。本方法在流動相的選擇上避免了應(yīng)用離子對試劑,選擇了常規(guī)緩沖鹽體系,雖然在分離度方面略微低于離子對試劑,但仍然能夠達到專屬性實驗的要求,降低了檢測成本,有利于臨床工作的常規(guī)開展。

        在前期研究中本課題組對不同固定相的色譜柱進行了篩選[9],本次研究在此基礎(chǔ)上對色譜柱的柱長和填料粒徑進行了考察。發(fā)現(xiàn)250 mm的色譜柱相對于150 mm的色譜柱而言,可以略延長保留時間,增加分離度,但總體無顯著性差異,因此選擇150 mm色譜柱可以提高效率,較適合臨床常規(guī)檢測工作。填料粒徑3.5 μm的色譜柱與5 μm的色譜柱相比,可以增加分離度,改善峰形。但對于生物樣品來說,往往雜質(zhì)較多,且蛋白沉淀難以完全,易導(dǎo)致色譜柱污染,同時3.5 μm的色譜柱的價格遠遠高于5 μm的色譜柱,大大提高成本。綜合以上特點,本課題組選擇150 mm的填料粒徑5 μm的色譜柱進行實驗,為以后臨床常規(guī)檢測奠定基礎(chǔ)。

        本方法在15 min內(nèi)可以完全出峰,考慮到生物藥品的復(fù)雜性,因此本課題組在15 min后加入一段較長時間的沖洗與次針預(yù)平衡時間,從而保證次針檢測的穩(wěn)定性與準確性。

        通過血藥質(zhì)量濃度監(jiān)測,可以避免因個體差異導(dǎo)致的血藥質(zhì)量濃度過高所致的不良反應(yīng),同時可以避免血藥質(zhì)量濃度過低導(dǎo)致的療效降低及耐藥性的產(chǎn)生。

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