譚玲玲，王 忠，胡正海(.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/山東省高校植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 青島 26609；2.西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 西安 70069)

桔梗(Platycodongrandiflorum(Jacq.) A.DC.)為桔?？?Campanulaceae)桔梗屬(Platycodon)多年生草本植物，是一種兼有食用、藥用、觀賞價(jià)值的植物，其藥用部位為根[1]?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》中已記載：桔梗性平，味苦、辛[2]，有止咳、祛痰、宣肺、排膿等作用[3]。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)桔梗的化學(xué)成分、藥理作用及臨床應(yīng)用等各方面進(jìn)行了深入研究。研究表明，桔梗含有多種化學(xué)成分，其主要藥用成分為總皂苷，還含有黃酮類化合物、多糖及脂肪酸等。其中的黃酮類化合物具有廣泛的生物活性，如增強(qiáng)心血管系統(tǒng)活性、抗菌及抗病毒活性、抗腫瘤活性及抗氧化自由基活性等[4]。因此，本實(shí)驗(yàn)利用超聲波，以乙醇作為提取溶劑對(duì)桔梗中總黃酮的提取工藝進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)以總黃酮含量為指標(biāo)，采用正交實(shí)驗(yàn)，考察了乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間及超聲次數(shù)對(duì)總黃酮得率的影響。以蘆丁為對(duì)照品，采用紫外分光光度法，在510 nm處測(cè)定提取液的吸光度，計(jì)算、比較總黃酮的提取效果，篩選出提取桔梗總黃酮的最佳提取條件，為桔梗藥材的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 AR1530電子天平(美國(guó)奧豪斯儀器(上海)有限公司)；KQ-3200DB型超聲提取儀(昆山市超聲儀器有限公司)；菲恰爾GL-16A型離心機(jī)(上海菲恰爾分析儀器有限公司)；XMTD-2MA型電熱恒溫水浴箱(龍口市先科儀器公司)；UNICO UV-2000型紫外可見光分光光度計(jì)(尤尼柯(上海)儀器有限公司)。

1.2試藥 實(shí)驗(yàn)用桔梗采自山東省淄博市博山區(qū)池上鎮(zhèn)，經(jīng)青島農(nóng)業(yè)大學(xué)初慶剛教授鑒定為桔?？平酃僦参锝酃?。選取健康植株的根、莖、葉，烘干、粉碎，過(guò)40目篩。樣品測(cè)定前經(jīng)60℃ 烘干15 h，取出，置于干燥器中冷卻至室溫備用。

蘆丁對(duì)照品購(gòu)自成都思科華生物技術(shù)有限公司(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98%)；乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁和氫氧化鈉等均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1因素及水平考察 根據(jù)桔?？傸S酮的理化性質(zhì)，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)(A)、超聲時(shí)間(B)和超聲次數(shù)(C)3個(gè)因素，每個(gè)因素選擇3個(gè)水平，設(shè)定因素水平表，見表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表

2.2桔?？傸S酮的測(cè)定

2.2.1對(duì)照品溶液配制 精密稱取蘆丁對(duì)照品7.26 mg，置于50 mL量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)70%乙醇，在沸水中溶解后，再用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇定容至刻度，搖勻，即得0.145 2 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確量取0.145 2 mg·mL-1的對(duì)照品溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL，分別置于50 mL量瓶中，分別加入體積分?jǐn)?shù)70%乙醇5.0，4.0，3.0，2.0，1.0和0 mL，再加入50 g·L-1亞硝酸鈉溶液0.7 mL，搖勻，靜置6 min；再加入100 g·L-1硝酸鋁溶液0.7 mL，搖勻，靜置6 min；再加入40 g·L-1氫氧化鈉溶液5 mL，搖勻。最后用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇定容，30～40 ℃水浴箱中顯色15 min。以試劑空白作為對(duì)照，在510 nm處分別測(cè)定其吸光度。以吸光度為橫坐標(biāo)、以對(duì)照品質(zhì)量濃度(μg·mL-1)為縱坐標(biāo)，得到回歸方程為Y=67.357X+0.182 5(r=0.998 8)，結(jié)果表明，蘆丁質(zhì)量濃度在2.904～14.52 μg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.2.3精密度實(shí)驗(yàn) 精確吸取質(zhì)量濃度為0.145 2 mg·mL-1的蘆丁對(duì)照溶液2.0 mL，6份，具體操作見2.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制，分別測(cè)定6次吸光度。RSD為1.25%(n=6)，表明本方法精密度良好。

2.2.4桔梗總黃酮樣品的提取 準(zhǔn)確稱取樣品2.0 g，置于離心管中，將一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇作為提取溶劑，置于超聲儀中超聲一定時(shí)間。超聲完畢后，在4 ℃下離心20 min(轉(zhuǎn)速為1200 r·min-1)。超聲完成后，對(duì)提取液進(jìn)行過(guò)濾，濾液置于50 mL量瓶中，以同樣體積分?jǐn)?shù)乙醇定容，搖勻。即為待測(cè)的樣品提取液。

2.2.5樣品含量測(cè)定 精密量取各樣品提取液10 mL，按2.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制項(xiàng)下方法測(cè)定其吸光度值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中總黃酮的含量。

2.3正交實(shí)驗(yàn)及結(jié)果 選取乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間和超聲次數(shù)3個(gè)水平為主要考察因素，以總黃酮吸光度為考察指標(biāo)，采用L9(34)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取平均值。正交實(shí)驗(yàn)方案中總黃酮的吸光度測(cè)定結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

由表2可以確定，利用超聲提取法提取桔梗中總黃酮的最佳條件為A3B3C3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、超聲時(shí)間50 min、超聲次數(shù)3次，桔?？傸S酮的提取效果最好。根據(jù)極差R的大小，可以判斷各因素對(duì)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的影響主次。R值越大，表示對(duì)指標(biāo)的影響越大。由表2分析可知，各因素對(duì)桔梗中總黃酮提取率的影響程度依次為C(超聲次數(shù))>A(乙醇體積分?jǐn)?shù))>B(超聲時(shí)間)。

由表3可知，其中超聲次數(shù)對(duì)桔梗中總黃酮的提取的影響顯著(PC=0.036<0.05)；而乙醇體積分?jǐn)?shù)(PA=0.105>0.05)和超聲時(shí)間(PB=0.204>0.05)對(duì)桔梗中總黃酮的提取的影響不顯著。

2.4最佳提取條件下桔梗根、莖、葉中總黃酮的含量 在最佳提取條件下，分別對(duì)桔梗根、莖、葉中的總黃酮的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明，桔梗根、莖、葉中總黃酮的含量分別為0.027%，0.039%和0.26%。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中使用超聲波對(duì)桔梗營(yíng)養(yǎng)器官中的總黃酮進(jìn)行高效地提取，提取效果較好，并且采用紫外分光光度法測(cè)定桔梗中總黃酮的含量，方法簡(jiǎn)單可行，易于操作。通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)方案對(duì)影響桔梗中總黃酮提取的因素(乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間、超聲次數(shù))進(jìn)行了研究，并得到了最佳工藝條件為A3B3C3，即乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、超聲時(shí)間50 min、超聲次數(shù)3次，桔?？傸S酮的提取效果最好。該提取工藝具有操作簡(jiǎn)單、提取率高等優(yōu)點(diǎn)，因此，可以作為提取桔梗中總黃酮的優(yōu)選方法。

同時(shí)，利用最佳實(shí)驗(yàn)條件對(duì)桔梗根、莖、葉中總黃酮的含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明，桔梗中總黃酮主要集中在葉中。結(jié)果提示我們對(duì)桔梗中總黃酮物質(zhì)的開發(fā)利用應(yīng)重點(diǎn)選擇葉片。這與譚玲玲[5]等對(duì)狹葉柴胡、王孟歌[6]等對(duì)山楂及李文芳[7]等對(duì)甘薯中總黃酮含量的研究結(jié)果相一致。在上述這些植物中，總黃酮均主要集中在葉中。目前，含有黃酮類化合物的植物雖然分布較為廣泛，但是受到資源、產(chǎn)量、栽培條件等因素的限制，不能廣泛獲取原材料[8]。從傳統(tǒng)的中藥學(xué)方面來(lái)看，桔梗和狹葉柴胡入藥的主要是根，山楂入藥的主要是果實(shí)，甘薯入藥的則是塊莖，一般很少會(huì)用到葉子。目前，這些植物的葉子基本上是作為廢棄物被丟棄，如果能利用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，對(duì)桔梗、狹葉柴胡、山楂、甘薯等植物的藥用部分采收時(shí)，采摘其葉進(jìn)行深加工，從中提取黃酮類化合物，不僅能夠變廢為寶，而且有利于農(nóng)民的增收，有著十分重大的經(jīng)濟(jì)和現(xiàn)實(shí)意義。

參考文獻(xiàn)：

[1] 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大詞典[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1997: 289.

[2] 譚玲玲，彭化勝，胡正海. 桔梗的生物學(xué)特性及化學(xué)成分研究進(jìn)展[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)， 2011，42(12)：1523-1527.

[3] 陸文總，楊亞麗，賈光鋒，等.桔梗多糖對(duì)U-14宮頸癌抗腫瘤作用的研究[J].西北藥學(xué)雜志，2013，28(1)：43-45.

[4] 武博，劉萍. 桔梗的現(xiàn)代研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥物應(yīng)用與監(jiān)測(cè)，2008，5(2)：1-3.

[5] 譚玲玲，蔡霞，胡正海.狹葉柴胡中黃酮類化合物含量及其動(dòng)態(tài)變化研究[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2012，43(2)：223-226.

[6] 王孟歌，田寶娟，喬鳳霞.山楂葉中總黃酮含量的測(cè)定[J].光譜實(shí)驗(yàn)室，2006，23(4)：1-3.

[7] 李文芳，田春蓮，黃美娥，等.甘薯葉和莖中黃酮類化合物含量的初步測(cè)定[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2005，21(4)：1-3.

[8] 李政浩，羅倉(cāng)學(xué).甘薯生產(chǎn)現(xiàn)狀及其資源綜合應(yīng)用[J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009(1): 75-77.