張繼業(yè)，杜 蕊，劉婷婷，楊范莉，童 華(.西安交通大學(xué)藥學(xué)院，西安 7006，.陜西省眼科研究所，西安市眼科醫(yī)院，西安市第一醫(yī)院，西安 7000；3.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院，西安 7006)

新疆紫草(Arnebiaeuchroma(Royle) Johnst)是紫草科軟紫草屬植物，也稱新疆軟紫草。作為傳統(tǒng)中藥，新疆紫草具有多種生物學(xué)活性，如抑菌、傷口愈合、抗病毒、抗炎、抗癌、抗腫瘤等[1-2]，在臨床上應(yīng)用廣泛。從紫草中分離提取出以紫草素為代表的萘醌類(lèi)成分為其主要活性成分。同時(shí)紫草素也是良好的天然色素，已廣泛用于食品和化妝品中。

目前報(bào)道的紫草素提取方法有溶劑萃取法、減壓蒸餾法、超聲提取法、微波提取法、超臨界萃取法等[3-5]。但受成本和設(shè)備限制，可應(yīng)用于大量生產(chǎn)的最優(yōu)提取方法仍是傳統(tǒng)的溶劑萃取法。而有研究發(fā)現(xiàn)，采用不同的溶劑提取紫草素會(huì)使得紫草提取物中紫草素含量差別較大，紫草素含量差異直接導(dǎo)致藥理活性不同[6]。本文以紫草素的提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選用4種常用的提取溶劑(石油醚、乙醇、氯仿、堿液)提取新疆紫草，篩選出最佳的紫草素提取方法。

1 儀器與試藥

1.1儀器 AY120電子分析天平(日本島津公司)；LC-2010A高效液相色譜儀(日本島津公司)；HWS-5A恒溫水浴鍋(上海百典儀器有限公司)；GENIUS 16K臺(tái)式高速離心機(jī)(長(zhǎng)沙市鑫奧儀器儀表有限公司)。

1.2試藥 左旋紫草素對(duì)照品，購(gòu)自南京狄爾格醫(yī)藥科技有限公司；紫草飲片購(gòu)自同仁堂陜西分公司，并由西安交通大學(xué)藥學(xué)院牛曉峰教授鑒定為新疆紫草；石油醚、氯仿、乙醇、氫氧化鈉、鹽酸、甲酸均為分析純；乙腈為色譜純(天津市科密歐試劑有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1提取液的制備 取已干燥至恒質(zhì)量的新疆紫草，粉碎過(guò)篩，精密稱取5.0 g，分別用45 mL石油醚、氯仿、乙醇、10 g·L-1氫氧化鈉堿液浸漬，在室溫避光條件下，攪拌30 min，過(guò)濾，藥材殘?jiān)貜?fù)提取1次，合并兩次濾液，得提取液，避光冷藏保存，待用。

2.2色譜條件 Waters XTerra?RP18色譜柱(150 mm× 4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相采用二元體系，A為含0.5 mL·L-1甲酸水溶液，B為乙腈，梯度洗脫，洗脫程序?yàn)椋? min時(shí)A相為95%，30 min時(shí)B相升至100%，并維持10 min；流速為1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為276 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為50 μL。

2.3對(duì)照品儲(chǔ)備液制備 精密稱取左旋紫草素對(duì)照品5.0 mg，置于25 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得200 μg·mL-1紫草素對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.4供試品溶液制備 精密量取1.0 mL紫草素提取液(石油醚提取液、氯仿提取液、乙醇提取液)，用乙醇稀釋至15 mL，以12 000 r·min-1離心10 min，取上清液作為供試品溶液。精密量取堿液提取液1.0 mL，加入1 mol·L-1鹽酸溶液1.0 mL，待沉淀析出完全，加乙醇稀釋至15 mL，以12 000 r·min-1離心10 min，取上清液作為供試品溶液。

2.5專屬性 取提取物樣品按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，記錄色譜圖，見(jiàn)圖1，紫草素色譜峰峰形良好，無(wú)雜峰干擾，保留時(shí)間為19.63 min，該方法具有良好的專屬性。

2.6標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密量取相應(yīng)體積紫草素對(duì)照品儲(chǔ)備液，置于量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制質(zhì)量濃度為12，10，8，6，4，2 和0.2 μg·mL-1對(duì)照品溶液。分別取上述溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析。以各對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行回歸計(jì)算，得紫草素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：Y=75 870.975 2X+2 564.526 7，相關(guān)系數(shù)r=0.999 6。表明紫草素在0.2 ～12 μg·mL-1范圍內(nèi)線性良好。

圖1 HPLC圖

2.7精密度 精密量取6 μg·mL-1對(duì)照品溶液50 μL，按2.2項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果紫草素RSD為1.82%，表明本法精密度良好。

2.8穩(wěn)定性 精密量取1 mL紫草素乙醇提取液，乙醇稀釋至10 mL作為供試品溶液，將供試品溶液置于室溫(25 ℃)條件下不避光保存。分別于0，2，4，6，8，10和12 h進(jìn)樣50 μL進(jìn)行分析，紫草素峰面積RSD為8.51%，表明在室溫不避光條件下，測(cè)定方法穩(wěn)定性不能滿足要求。將同一供試品溶液避光冷藏條件下保存，按上述方法測(cè)定，結(jié)果紫草素峰面積RSD為2.93%。證明在避光冷藏下，紫草素的測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定性良好，故在測(cè)定過(guò)程中樣品應(yīng)注意避光和冷藏。

2.9含量測(cè)定 按2.4項(xiàng)下的方法制備4種提取液供試品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算紫草素的含量后換算成提取率。紫草素在堿液、氯仿、乙醇和石油醚中的提取率分別為0.996%±0.07%，0.785%±0.065%，0.982%±0.061%和0.568%±0.054%(n=3)。

3 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在3種有機(jī)溶劑中紫草素提取率差別較大(乙醇>氯仿>石油醚)，原因在于紫草素在3種有機(jī)溶劑中的溶解度不同。在室溫條件下，在該投料量與溶劑比下，紫草素在乙醇中的溶解度最大，提取量最大。

4種提取溶劑堿液提取紫草素提取率最大。紫草中萘醌類(lèi)成分雖為脂溶性成分，但紫草素及其衍生物可在堿液中成鹽，溶解度增加，利于萘醌類(lèi)成分的提取。堿液提取與有機(jī)溶劑提取相比，堿液提取時(shí)，提取物中強(qiáng)極性雜質(zhì)成分較多，而酸沉再經(jīng)乙醇萃取后，可去除一些強(qiáng)極性雜質(zhì)，提取物中雜質(zhì)含量減少。

有研究表明，紫草素具有光不穩(wěn)定性，同時(shí)由于萘醌類(lèi)結(jié)構(gòu)中羥基存在使得紫草素也易被氧化。通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)獲知，長(zhǎng)時(shí)間置于空氣中，紫草素的含量會(huì)下降。本實(shí)驗(yàn)在避光條件下，選擇相對(duì)較短的提取時(shí)間(30 min)重復(fù)2次提取進(jìn)行分析。

綜上所述，堿提酸沉后經(jīng)乙醇萃取為最適的提取方法，能夠在提高提取物中紫草素含量的同時(shí)，降低提取物中雜質(zhì)的含量。采用堿液提取能夠有效節(jié)省有機(jī)溶劑的用量，減少成本，同時(shí)降低環(huán)境污染。

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