朱杭飛，姜曉明，藏雨軒，張雲(yún)喬，向國艷，張中新，郝 峰* (吉林醫(yī)藥學(xué)院：.生物化學(xué)檢驗教研室，.免疫教研室，吉林 吉林 303)

限制性核酸內(nèi)切酶是一種可以識別DNA的特異序列，并在識別位點或其周圍切割雙鏈DNA的一類內(nèi)切酶[1]。約翰霍普金斯大學(xué)的丹尼爾·那森斯、漢彌爾頓·史密斯與伯克利加州大學(xué)的沃納·亞伯因為限制性內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)與研究而獲1978年度的諾貝爾生理學(xué)獎，開創(chuàng)了分子遺傳學(xué)的新篇章[2]。目前，限制性內(nèi)切酶的酶切技術(shù)因其操作簡單和快速等優(yōu)點廣泛應(yīng)用分子生物學(xué)等領(lǐng)域。雙酶切更為廣泛應(yīng)用于載體構(gòu)建等分子生物學(xué)實驗，因為單酶切后連接目的基因理論上會出現(xiàn)50%可能的錯誤性，而雙酶切后的不同黏性末端在一定程度上避免單酶切的不足[3]。KpnⅠ和EcoRⅠ是目前常用的限制性內(nèi)切酶，屬第Ⅱ型限制性內(nèi)切酶，來源方便、價格便宜，廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)實驗[4]。試劑公司會給出這兩種酶的適合緩沖液，但這兩種限制性內(nèi)切酶的最適緩沖液離子濃度相差較大，給這兩種酶的應(yīng)用帶來一定不便。本研究選取KpnⅠ和EcoRⅠ不同的酶切體系，探討KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切的適宜實驗條件，為今后應(yīng)用KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切實驗提供科學(xué)的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

KpnⅠ、EcoRⅠ、緩沖液H、緩沖液L、Bovine Serum Albumin (BSA)、Loading Buffer和Ethidiμm Bromide(Takara公司)；pEGFP-Ano2質(zhì)粒(本實驗室前期構(gòu)建)；TAE、瓊脂糖(Agar)和DL5000 DNA marker(Promega公司)；Nanodrop 2000分光光度計(Thermo公司)；質(zhì)粒提取試劑盒(Axygen公司)；DNA瓊脂糖凝膠電泳儀(Biorad公司)；凝膠成像系統(tǒng)(德國alpha FluorChem HD2)。

1.2 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化、提取和測序

將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)DH5α中，在含卡那抗性的固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，次日挑取單個陽性克隆于5 mL卡那抗性的液體LB中，放于37 ℃ 180 r/min的搖床中過夜后，質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，Nanodrop 2000分光光度計測其濃度和純度，并于上海生工測序。

1.3 KpnⅠ和EcoRⅠ分別單酶切pEGFP-Ano2

取0.5 mL離心管，配制50 μLKpnⅠ單酶切體系，加入1 μLKpnⅠ、5 μL 10×Buffer L和1 μg質(zhì)粒，其余體積用超純水補齊，置于37 ℃恒溫水浴鍋中1 h，瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果。

另取0.5 mL離心管，配制50 μLEcoRⅠ單酶切體系，加入1 μLEcoRⅠ、5 μL 10×Buffer H和1 μg質(zhì)粒，其余體積用超純水補齊，置于37 ℃恒溫水浴鍋中1 h，瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果。

瓊脂糖凝膠電泳具體步驟如下：稱取0.3 g Agar放入一錐形瓶中，加入30 mL 1×TAE電泳緩沖液，置微波爐加熱至完全溶化，呈透明狀，倒入制膠板上，加5 μL EB，混勻，在一端插入梳子，冷卻凝固后，拔起梳子。把上述的各個樣品從37 ℃恒溫水浴鍋中移出，吸一半入另一離心管中，各加入3 μL Loading Buffer，混勻。取一離心管加入1 μL質(zhì)粒、2 μL Loading Buffer作為對照。用移液槍把各個樣品和已知分子量的DL 5000 DNA marker按一定順序加至凝膠的加樣孔中，在電泳槽中加入適量1×TAE。最后接通DNA瓊脂糖凝膠電泳儀，調(diào)節(jié)電壓和電流，開始電泳。觀察溴酚藍(lán)的位置，當(dāng)其移動至瓊脂糖凝膠一半時，結(jié)束電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察酶切條帶。

1.4 不同的單酶切體系KpnⅠ和EcoRⅠ單酶切pEGFP-Ano2

第一組取0.5 mL離心管，配制50 μLKpnⅠ單酶切體系，加入1 μLKpnⅠ、5 μL 10×Buffer L和1 μg質(zhì)粒，其余體積用超純水補齊，放入37 ℃恒溫水浴鍋中1 h后，加入5 μL 10×Buffer H水浴1 h，瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果。

第二組取0.5 mL離心管，配制50 μLEcoRⅠ單酶切體系，加入1 μLEcoRⅠ、5 μL 10×Buffer H、5 μL 10×Buffer L和1 μg質(zhì)粒，其余體積用超純水補齊，放入37 ℃恒溫水浴鍋中0.5 h，瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果。

第三組取0.5 mL離心管，配制50 μLEcoRⅠ單酶切體系，加入1 μLEcoRⅠ、5 μL 10×Buffer H、5 μL 10×Buffer L和1 μg質(zhì)粒，其余體積用超純水補齊，放入37 ℃恒溫水浴鍋中1 h，瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果。

第四組取0.5 mL離心管，配制50 μLEcoRⅠ單酶切體系，加入1 μLEcoRⅠ、5 μL 10×Buffer H、5 μL 10×Buffer L、5 μL BSA和1 μg質(zhì)粒，其余體積用超純水補齊，置37 ℃恒溫水浴鍋中1 h，瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果。

瓊脂糖凝膠電泳具體見以上步驟，并每個實驗均重復(fù)3次。

1.5 KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切質(zhì)粒pEGFP-Ano2

取0.5 mL離心管，配制50 μLKpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切體系，加入1 μLKpnⅠ、5 μL 10×Buffer L和1 μg質(zhì)粒，其余體積用超純水補齊，置37 ℃恒溫水浴鍋中1 h后，加入1 μLEcoRⅠ、5 μL BSA和5 μL 10×Buffer H水浴1 h，瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切結(jié)果。瓊脂糖凝膠電泳具體見以上步驟，并每個實驗均重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 重組質(zhì)粒質(zhì)量測定結(jié)果

應(yīng)用Nanodrop 2000分光光度計檢測重組質(zhì)粒的濃度和純度，結(jié)果顯示在260 nm處有最大吸收峰，濃度為349.5 mg/L，260/280為1.78，260/230為2.13，結(jié)果表明獲得質(zhì)量良好的重組質(zhì)粒。結(jié)果見圖1。

2.2 重組質(zhì)粒測序結(jié)果

測序結(jié)果顯示在目的基因上游的限制性內(nèi)切酶位點為EcoRⅠ，下游限制性內(nèi)切酶切位點為KpnⅠ。結(jié)果見圖2。

2.3 KpnⅠ和EcoRⅠ分別單酶切pEGFP-Ano2

KpnⅠ和EcoRⅠ分別單酶切質(zhì)粒，結(jié)果顯示將質(zhì)粒pEGFP-Ano2酶切為一條7 400 bp的條帶，結(jié)果表明，本實驗所用KpnⅠ和EcoRⅠ質(zhì)量良好，KpnⅠ在1×Buffer L條件下可發(fā)揮較好活力，EcoRⅠ在1×Buffer H條件下可發(fā)揮較好活力。結(jié)果見圖3。

圖 1 重組質(zhì)粒pEGFP-Ano2濃度和純度檢測

圖 2 重組質(zhì)粒pEGFP-Ano2測序結(jié)果

圖 3 重組質(zhì)粒pEGFP-Ano2單酶切電泳圖

2.4 不同的單酶切體系KpnⅠ和EcoRⅠ單酶切pEGFP-Ano2

KpnⅠ在1×Buffer L酶切1 h，再加入1× Buffer H酶切1 h的條件下，結(jié)果顯示KpnⅠ將質(zhì)粒pEGFP-Ano2酶切為大小7 400 bp的條帶，則證實在此條件下KpnⅠ可將質(zhì)粒pEGFP-Ano2酶切徹底,見圖4-A。EcoRⅠ在含1×Buffer H和1×Buffer L的共同條件下，單酶切0.5 h，結(jié)果顯示出現(xiàn)兩條清晰的條帶，一條為7 400 bp，另一條與Ano2酶切結(jié)果中的最后一條條帶對齊，則表明此條件下EcoRⅠ酶切不徹底,見圖4-B。延長EcoRⅠ酶切時間，結(jié)果顯示EcoRⅠ的條帶出現(xiàn)彌散現(xiàn)象，則表明在此條件下EcoRⅠ酶切時間過長而發(fā)生星活性,見圖4-C。EcoRⅠ單酶切體系中加入BSA后，結(jié)果顯示EcoRⅠ將質(zhì)粒pEGFP-Ano2酶切為大小7 400 bp的條帶，則證實在此條件下EcoRⅠ可將1 μg含有EcoRⅠ酶切位點的載體pEGFP-Ano2徹底酶切,見圖4-D。

圖 4 重組質(zhì)粒pEGFP-Ano2單酶切電泳圖

2.5 KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切質(zhì)粒結(jié)果

根據(jù)KpnⅠ和EcoRⅠ單酶切質(zhì)粒pEGFP-Ano2的適宜條件，將其應(yīng)用于KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切實驗中，結(jié)果顯示KpnⅠ和EcoRⅠ將質(zhì)粒pEGFP-Ano2雙酶切為兩條清晰條帶，分別為4 700 bp和2 700 bp。結(jié)果見圖5。

3 討 論

KpnⅠ和EcoRⅠ是兩種常用的限制性內(nèi)切酶，廣泛應(yīng)用于載體構(gòu)建、DNA探針制備以及DNA序列分析等多種分子生物學(xué)實驗[5]。KpnⅠ的專一識別順序是5′…GGTAC↓C…3′，推薦的緩沖液是1×Buffer L，組分為100 mol/L Tris-HCl、100 mmol/L MgCl2和10 mmol/L Dithiothreitol，pH 7.5；EcoRⅠ的專一識別順序是5′…G↓AATTC3′，推薦緩沖液為1×Buffer H，內(nèi)含500 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L MgCl2、10 mmol/L Dithiothreitol和1.000 mmol/L NaCl，pH 7.5。Buffer H和Buffer L的離子濃度不同，會影響限制性內(nèi)切酶酶切效果，并且酶的種類、質(zhì)粒的濃度、純度和酶切時間等因素都可能對酶切效果產(chǎn)生重要影響。例如質(zhì)粒中含有過多的酚、酒精、氯仿、EDTA、變性劑或過多鹽離子的污染都會影響質(zhì)粒質(zhì)量,引起酶切不完全或者星活性的產(chǎn)生，而質(zhì)粒濃度過高、酶濃度量過低或者不適當(dāng)?shù)南拗菩悦傅谋４婧蛻?yīng)用都可能造成酶切不徹底。BSA是一種牛血清白蛋白，可以通過提高溶液中蛋白質(zhì)的濃度，防止酶的分解和非特異性吸附，減輕某些酶的變性，從而對酶起保護(hù)作用，廣泛應(yīng)用于限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)實驗中[6]。酶切時間過長，會出現(xiàn)星活性現(xiàn)象。星活性是反應(yīng)條件不同而產(chǎn)生的切斷與原來認(rèn)識序列不同的位點的現(xiàn)象，多由于酶切時間延長等因素[7]。

圖 5 重組質(zhì)粒pEGFP-Ano2雙酶切電泳圖

在本實驗選取上下游含有KpnⅠ和EcoRⅠ的pEGFP-Ano2質(zhì)粒，應(yīng)用質(zhì)粒提取試劑盒提取該質(zhì)粒和Nanodrop 2000分光光度計檢測其濃度和純度，并應(yīng)用瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)粒完整性，實驗結(jié)果表明濃度和純度都符合要求。KpnⅠ和EcoRⅠ分別在1×Buffer L和1×Buffer H的條件下酶切1 h，結(jié)果顯示均為只有一條明顯的7 400 bp的條帶，證實本研究所用的限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和EcoRⅠ質(zhì)量良好,KpnⅠ在1×Buffer L條件下可發(fā)揮較好活力，EcoRⅠ在1Buffer H條件下可發(fā)揮較好活力。為獲取KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切質(zhì)粒pEGFP-Ano2的適宜條件，進(jìn)行KpnⅠ和EcoRⅠ單酶切體系的探索。KpnⅠ在1×Buffer L酶切1 h，再在含1×Buffer H酶切1 h時，實驗結(jié)果顯示只有一條明顯的7 400 bp的條帶，表明在上述條件下KpnⅠ可將質(zhì)粒pEGFP-Ano2酶切徹底。EcoRⅠ在1×Buffer H和1×Buffer L酶切0.5 h的條件下，顯示酶切不完全，可能是鹽濃度降低的因素，從而延長EcoRⅠ的酶切時間，但產(chǎn)生星活性而發(fā)生彌散現(xiàn)象。加入具有保護(hù)酶特性的BSA，實驗結(jié)果表明此為EcoRⅠ單酶切質(zhì)粒的適宜條件。因此，KpnⅠ和EcoRⅠ單酶切質(zhì)粒的適宜條件應(yīng)用于雙酶切中，實驗結(jié)果顯示為兩條正確的條帶，分別為4 700 bp和2 700 bp，則成功獲取KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切質(zhì)粒的適宜條件：首先在1×L緩沖液的情況下，應(yīng)用1 μLKpnⅠ酶切1 μg質(zhì)粒1 h，再加入1×H緩沖液和0.01% BSA，應(yīng)用1 μLEcoRⅠ繼續(xù)酶切1 h。

總之，本實驗獲取KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切質(zhì)粒的適宜條件，為今后實驗提供科學(xué)的參考依據(jù)。

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