官福新，周露露，張宸豪，李 妍* (吉林醫(yī)藥學(xué)院：.藥學(xué)院0級(jí)藥學(xué)本班，.藥學(xué)院00級(jí)藥學(xué)本班，.檢驗(yàn)學(xué)院，吉林 吉林 0)

線粒體是細(xì)胞內(nèi)能量代謝的重要細(xì)胞器，是決定生存的控制中心。在細(xì)胞生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、腫瘤學(xué)等研究領(lǐng)域，均需要通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞線粒體功能而開展研究或輔助診斷疾病[1]。粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)變化可反應(yīng)線粒體功能的變化，有必要建立和優(yōu)化簡(jiǎn)單、敏感和快速檢測(cè)MMP的方法[2]。本研究采用碳酰氰基-對(duì)-氯苯腙(carbonyl cyano-to-chlorobenzene hydrazone，CCCP)來(lái)?yè)p傷線粒體功能，分別裝載常用熒光探針Rh123和新型探針JC-1進(jìn)行，流式細(xì)胞術(shù)分析CCCP損傷細(xì)胞后MMP的變化，探索檢測(cè)過(guò)程中的注意事項(xiàng)，建立更為穩(wěn)定和敏感的MMP分析方法。

1 材料與方法

1.1 材 料

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ECV304保存于液氮中。熒光探針JC-1和Rh123購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；1640培養(yǎng)液購(gòu)自Gibco公司；小牛血清購(gòu)自Hyclone公司；胰蛋白酶和EDTA為Sigma公司產(chǎn)品。流式細(xì)胞儀型號(hào)為Epics XL(美國(guó)貝克曼公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和傳代

實(shí)驗(yàn)前1周復(fù)蘇ECV-304細(xì)胞，含10%小牛血清1640培養(yǎng)液、5%CO2、飽和濕度和37℃條件下培養(yǎng)。含0.5%胰蛋白酶0.2%EDTA的消化液消化細(xì)胞，2～3 d傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 CCCP處理細(xì)胞

調(diào)細(xì)胞密度為105/mL,按每瓶10 mL接種于75 mL培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)24 h。加入CCCP儲(chǔ)存液至終濃度分別為0、0.1、1和10 μmol/L,處理細(xì)胞20 min后，消化收集細(xì)胞，PBS洗2次。

1.4 裝載探針和流式細(xì)胞術(shù)分析

每組取5×105個(gè)細(xì)胞，按如下方法裝載Rh123探針并用流式細(xì)胞術(shù)分析：按說(shuō)明書(產(chǎn)品編號(hào)C2006)方法配制JC-1染色工作液和染色緩沖液(冰沐)；500 μL JC-1染色工作液懸細(xì)胞，37 ℃條件下反應(yīng)30 min；離心吸棄上清，用冰沐的染色緩沖液洗滌細(xì)胞2次；500 μL染色緩沖液重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀FL1通道(525 nm)的檢測(cè)細(xì)胞發(fā)射的熒光。每組取5×105個(gè)細(xì)胞，按如下方法裝載Rh123探針和流式細(xì)胞術(shù)分析：將細(xì)胞懸浮于500 μmol PBS，加入Rh123 儲(chǔ)存液(1.25 mol/L) 1 μL，混勻后37 ℃水沐中避光反應(yīng)30 min；離心棄上清，PBS洗滌2次后用流式細(xì)胞儀FL1通道檢測(cè)細(xì)胞發(fā)射的熒光。

2 結(jié) 果

2.1 JC-1法檢測(cè)CCCP對(duì)線粒體膜電位的影響

裝載JC-1探針、流式細(xì)胞術(shù)分析CCCP處理后細(xì)胞內(nèi)綠色熒光的變化，結(jié)果表明，細(xì)胞內(nèi)代表JC-1單體的綠色熒光隨CCCP濃度而增加(圖1)。

圖 1 JC-1法檢測(cè)CCCP對(duì)線粒體膜電位的影響

2.2 Rh123法分析CCCP對(duì)線粒體膜電位的影響

Rh123染色后、流式細(xì)胞術(shù)分析CCCP處理后細(xì)胞內(nèi)綠色熒光的變化(圖2)。與對(duì)照組比較，0.1 μmol CCCP處理后，Rh123的熒光強(qiáng)度下降，但伴隨CCCP濃度增加(1和10 μmol)后，Rh123的綠色熒光反而增加，即熒光強(qiáng)度與CCCP對(duì)線粒體功能損傷的效應(yīng)未呈現(xiàn)對(duì)應(yīng)關(guān)系。

圖 2 Rh123法分析CCCP對(duì)線粒體膜電位的影響

3 討 論

線粒體是細(xì)胞內(nèi)能量轉(zhuǎn)換和控制細(xì)胞凋亡的重要細(xì)胞器，也決定生存與死亡的控制中心[3]。部分不育男性的精子運(yùn)動(dòng)能力下降，可檢測(cè)到精子的線粒體膜電位下降。心臟在缺血后再灌注時(shí)，心肌細(xì)胞內(nèi)活性氧增加，導(dǎo)致細(xì)胞線粒體功能受損和線粒體膜電位下降。增殖旺盛的腫瘤細(xì)胞，線粒子功能活躍，而采用藥物干預(yù)線粒體功能是治療腫瘤的策略之一。簡(jiǎn)言之，檢測(cè)線粒體功能在細(xì)胞生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)和腫瘤學(xué)等研究領(lǐng)域中均有重要應(yīng)用。

熒光染料Rh123可因線粒體內(nèi)外的電位差而吸附結(jié)合于線粒體，成為分析線粒體功能的常用染料[4]。但被檢測(cè)的細(xì)胞大量壞死或發(fā)生晚期凋亡后，細(xì)胞膜的通透性增加，加速Rh123進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，線粒體對(duì)其吸附的能力下降；在染色后洗滌的過(guò)程中，Rh123又不同程度地漏出。實(shí)際工作中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重壞死的情況下，Rh123的熒光與線粒體膜電位無(wú)較好對(duì)應(yīng)關(guān)系。JC-1是一種新型熒光探針，進(jìn)入線粒體后，其存在狀態(tài)和發(fā)射熒光與線粒體的功能聯(lián)系緊密：在線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，可以產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1不能聚集在線粒體基質(zhì)中，此時(shí)JC-1主要以單體形式存在，發(fā)綠色熒光[5]。CCCP可以濃度依賴的方式損傷線粒體功能，導(dǎo)致線粒體膜電位下降。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，在不同濃度CCCP處理后，JC-1染色后所檢測(cè)的綠色熒光強(qiáng)度隨著CCCP濃度增加而增強(qiáng)。但以Rh123為探針，其發(fā)射的熒光在CCCP濃度較高時(shí)，呈現(xiàn)假性增加的趨勢(shì)。

簡(jiǎn)言之，與Rh123比較，JC-1是更為理想的檢測(cè)線粒體膜電位的熒光探針。除探針種類的因素外，實(shí)驗(yàn)過(guò)程尚需要在如下方面注意，以保證分析結(jié)果穩(wěn)定：①在培養(yǎng)瓶或孔板內(nèi)所接種細(xì)胞量要適當(dāng)，以免細(xì)胞密度過(guò)高導(dǎo)致代謝毒性產(chǎn)物增加、細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制；②可嘗試不同的消化液來(lái)消化、傳代細(xì)胞，避免此過(guò)程中過(guò)度損傷細(xì)胞；③洗滌細(xì)胞的過(guò)程中，可用移液器吸去上清液，既減少細(xì)胞的丟失又減少液體殘留，達(dá)到充分洗滌未結(jié)合的探針的目的。

致謝：感謝公共衛(wèi)生學(xué)院王長(zhǎng)文副教授在文獻(xiàn)閱讀和英文寫作過(guò)程中給予的悉心指導(dǎo)。

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[2] 陳 莎，張 翔，張舒越，等.抗霉素A直接刺激線粒體所引起的超氧陰離子含量和膜電位變化的單線粒體水平研究[J].廈門大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2013,52(4):525-528.

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[5] 李 妍.流式細(xì)胞術(shù)入門及平臺(tái)化管理[M].長(zhǎng)春：吉林大學(xué)出版社，2012.