曹 勇 蔡 偉 黃林義 張中文

南京醫(yī)科大學附屬江寧醫(yī)院普外二科 南京 211100

急性胰腺炎(Acute Pancreatitis，AP)是外科常見的急腹癥，其發(fā)病機制的腺泡細胞凋亡學說近年來引人注目［1］，而奧曲肽對AP 的治療效果已經(jīng)得到臨床普遍認可［2］，但其作用機理尚未完全清楚。本課題試圖通過奧曲肽誘導胰腺腺泡細胞凋亡的角度，初步探討其治療胰腺炎的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及試劑 SD 大鼠由南通大學實驗動物中心提供，蛙皮素購自美國Sigma 公司，原位細胞凋亡檢測試劑盒(TUNEL 試劑盒)、血清淀粉酶(AMY)檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。TaqDNA 聚合酶及緩沖系統(tǒng)、蛋白酶K、脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)、Fluorescein -dUTP、RNA 酶抑制劑(rRNasin)由美國Promega 公司提供。

1.2 動物分組、模型制備 SD 大鼠30 只，雌雄不限，體質(zhì)量250～300 g。將動物隨機分為三組，每組10 只，試驗前禁食不禁水12 h。(1)空白對照組。(2)急性胰腺炎組:麻醉后于大鼠后肢根部皮下注射蛙皮素15 g/只，1 次/h，共4 次。(3)急性胰腺炎治療組:按奧曲肽0.001 mg/kg，后肢根部皮下注射，1 次/8h，制作AP 模型過程同［2］。

1.3 檢測方法

1.3.1 血清AMY 檢測 采用碘-淀粉比色法測定，細胞凋亡檢測采用末端脫氧核苷酸介導的dUTP 缺口末端標記(TUNEL)法。凋亡指數(shù)(Apoptotic Index，AI)計算方法:數(shù)4個高倍鏡視野，每個視野中計算250個腺泡中凋亡細胞數(shù)。病理組織學評分標準按改良Schmidt 法［3］進行。

1.3.2 逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(RT -PCR)檢測 引物序列均由南京若爾曼生物技術有限公司合成，引物信息如下:

檢測步驟:(1)總RNA 的制備。(2)RT 反應。(3)PCR 反應。(4)反應結束后進行PCR 產(chǎn)物電泳。

1.4 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)采用Stata7.0 版本進行統(tǒng)計學處理。測定數(shù)值以(±s)表示，數(shù)據(jù)間比較采用方差分析，兩兩比較采用q 檢驗，兩者間相關關系采用直線相關分析。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠胰腺組織內(nèi)Bax mRNA 經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應后檢測的表達情況 結果以各組測得的光密度值與內(nèi)參β -actin 的光密度值之比值表示，見表1。

表1 各組組織內(nèi)Bax mRNA 表達 (±s)

表1 各組組織內(nèi)Bax mRNA 表達 (±s)

注:#與正常對照組相比P ＜0.05;●與急性胰腺炎組相比P＜0.05

正常對照組(n=10)急性胰腺炎組(n=10)治療組(n=10)Bax mRNA 0.2196±0.04466 0.3765±0.0566# 0.6959±0.0784#●

2.2 各組血清AMY 與各組病理組織學評分情況及胰腺組織細胞凋亡變化情況 治療組血清AMY、病理組織學評分較AP 組均顯著降低(P ＜0.05)，治療組血清胰腺組織細胞凋亡指數(shù)較AP 組明顯升高(P ＜0.05)，見表2。

表2 各組大鼠AMY 與TNF-α 水平變化情況 (±s)

表2 各組大鼠AMY 與TNF-α 水平變化情況 (±s)

注:#與正常對照組相比P ＜0.05;＊與急性胰腺炎組相比P ＜0.05

組別 n AMY(u/l) 細胞凋亡指數(shù)(AI%)病理組織學評分正常對照組10 604.90 ±114.89 1.45 ±0.33 0.90 ±0.74急性胰腺炎組 10 2235.81 ±466.52# 21.30 ±1.21# 8.20 ±0.79#治療組 10 1342.33 ±222.92#＊ 28.79 ±1.43#＊ 3.80 ±0.92#＊

2.3 各檢測指標間的相關分析 各組大鼠胰腺腺泡細胞凋亡指數(shù)與胰腺組織病理學評分呈負相關，相關系數(shù)為r2= -0.97(P ＜0.05);各組大鼠胰腺細胞凋亡指數(shù)與胰腺組織內(nèi)Bax mRNA 之間呈正相關，相關系數(shù)為r3=0.73(P ＜0.05);各組大鼠胰腺組織病理學評分與胰腺組織Bax mRNA 之間呈負相關，相關系數(shù)為r1= -0.54(P ＜0.05)。

3 討論

急性胰腺炎(AP)的細胞凋亡學說是近年來研究AP 發(fā)病機制的又一個熱點領域，該學說認為［1］:在AP 的發(fā)病過程中，胰腺腺泡細胞的凋亡同疾病密切相關，即腺泡細胞的凋亡是對機體較為有利的一種反應，其凋亡程度同AP 病情的嚴重程度呈負相關，胰腺細胞凋亡越多，則胰腺組織病理學損害越輕。本課題結果也顯示:正常對照組腺泡細胞的凋亡細胞很少;AP經(jīng)治療后凋亡指數(shù)較同型明顯上升，其組織病理學損害的減輕(P ＜0.05);AP 凋亡指數(shù)與胰腺組織病理學評分呈負相關(P ＜0.05)，進而驗證了“細胞凋亡學說”觀點。

奧曲肽(sandostatin)是人工合成的生長抑素的八肽衍生物，為治療急性胰腺炎的主藥，其療效已為臨床認可。通常認為奧曲肽治療急性胰腺炎的作用機制包括以下多方面的［4-5］:(1)抑制胃腸道消化液和胰腺外分泌液分泌;(2)抑制內(nèi)分泌激素的分泌、抑制膽囊收縮;(3)抑制炎性細胞因子的生成和釋放;(4)使膽管括約肌張力降低，從而使胰管內(nèi)壓力下降;(5)改善胰腺炎患者血流動力學、機體代謝狀態(tài);(6)細胞保護作用;(7)減少液體丟失和在第三間隙聚集，降低嚴重并發(fā)癥的發(fā)生率等。然而，奧曲肽對AP 的治療作用機制中，是否涉及誘導腺泡細胞的凋亡、減輕胰腺組織病理學的損害，鮮有文獻報道。

Bax 基因?qū)儆贐cl-2 基因家族。Bcl-2 基因家族是最受關注的細胞凋亡相關的基因，Bcl -2 家族可形成共聚體促進細胞凋亡［6］。以往有研究證實Bax 基因是一種凋亡調(diào)控基因［7］，轉(zhuǎn)染Bax 基因后細胞的凋亡指數(shù)增高。促凋亡基因Bax 表達上調(diào)，必然使腺泡細胞凋亡增加，胰腺炎病情的嚴重程度減輕。通過本實驗發(fā)現(xiàn)，奧曲肽治療組與AP 組相比胰腺組織Bax mRNA表達水平明顯增高(P ＜0.05)，且胰腺組織Bax mRNA 表達水平與其細胞凋亡指數(shù)呈顯著正相關(P ＜0.05)，凋亡指數(shù)亦明顯增高(P ＜0.05)，提示奧曲肽對大鼠急性胰腺炎的治療作用可能還通過誘導AP 腺泡細胞的凋亡這一途徑，進一步減輕AP 的病情。

［1］Leindler L，Morschl E，Laszlo F，Mandi Y，Takacs T，Jarmai K，F(xiàn)arkas G. Importance of cytokines，nitric oxide，and apoptosis in the pathological process of necrotizing pancreatitis in rats［J］. Pancreas，2004，29(2):157 -161.

［2］Zhou Liming，Wan Lihong，el a1. Effect of emodin on experimental acute necrotics pancreatitis in rat ［J］. Pharmacology and Clinics of Chinese Materia Medica. 2006;22 (2)15-16.

［3］Schmidt J，Lewandrowsi K，Warshaw AL，et al. Morphometric characteristic and homogeneity of a new model of acute pancreatitis in the rat［J］. Internat J pancreatol，1992，12(3):41 -51.

［4］Uhl W，Anghelacopoulos SE，F(xiàn)riess H，et al. The role of octreotideand somatostatin in acute and chronic pancreatitis. Digestion，1999，60(Suppl2):23 -31.

［5］劉丕，朱勇，徐龍，等. 加倍生長抑素聯(lián)合早期腸內(nèi)營養(yǎng)對重癥急性胰腺炎炎癥因子和腸通透性的影響［J］. 山東醫(yī)藥，2010，50(25):55.

［6］Ornberg RL. Proliferation and apoptosis measurement by color image analysis based on differential absorption［J］. Jhistochen cytochem，2001，49:1 059 -1 060.

［7］Yang LJ.Wang WL. Establishment of the hepatoma cells which express Bax protein stably and highly and observation of its apoptotic phenomema［J］. Di-si Junyi Daxue Xuebao (J Fourth Mil Med Univ). 2002，23(5):455 -458.