陳穎，朱萍妹，劉巧玲，潘華，周光興

(復旦大學實驗動物科學部，上海 200032)

肥大細胞(mast cell, MC)自報道以來，已被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于人和動物的多種組織器官內(nèi)，在機體免疫反應、抗腫瘤、抗寄生蟲感染反應及神經(jīng)-體液-免疫調(diào)節(jié)通路中發(fā)揮著重要作用[1]。這些功能的實現(xiàn)源于MC內(nèi)富含的多種生物活性介質(zhì)和細胞因子，MC在外周組織發(fā)育成熟過程中，形成不同的細胞表型[2]，其形態(tài)、分布、所含介質(zhì)種類和功能均存在明顯的異質(zhì)性(heterogeneity)。目前已有少量有關人及多種動物體內(nèi)MC異質(zhì)性的研究報道，但常用實驗動物體內(nèi)MC分布和功能的異質(zhì)性至今未見系統(tǒng)報道，尤其對犬和猴MC的研究更為少見。本實驗從MC分布、數(shù)量、形態(tài)、分型、超微結構及P物質(zhì)免疫反應性等方面，對六種實驗動物的皮膚、肺臟、乙狀結腸和脾臟中的MC進行觀察，首次對常用實驗動物多種組織內(nèi)MC進行了系統(tǒng)的比較組織學研究，以期為探討不同實驗動物MC的功能及意義提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF級KM小鼠10只，體重18～22 g，1.5月齡；SPF級SD大鼠10只，體重150～250 g，2月齡。均購于復旦大學實驗動物科學部[SCXK(滬)2009-0019]。清潔級Hartley豚鼠10只，體重800～1000 g，5月齡；清潔級新西蘭兔10只，體重4～5 kg，6月齡。均購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司[SCXK(滬)2012-0002]。普通級比格犬6只，體重7～10 kg，2歲；普通級食蟹猴6只，體重4～7 kg，5歲。均購于蘇州西山中科實驗動物有限公司[SCXK(蘇)2012-0009]。以上動物均雌雄對半。小鼠、大鼠、豚鼠和兔的組織取材于復旦大學實驗動物科學部動物實驗設施內(nèi)進行【SYXK(滬)2009-0082】，犬和猴的組織取材于蘇州西山中科藥物研究開發(fā)有限公司動物實驗設施內(nèi)進行【SYXK(蘇)2011-0028】。常規(guī)麻醉后，取頸背部皮膚，立即打開胸腔、腹腔，取肺臟、脾臟和乙狀結腸。組織固定后，作常規(guī)石蠟切片，行HE染色，部分動物作組化及免疫組化染色，光鏡下觀察。另取六種動物1 mm×1 mm×3 mm皮膚組織，作常規(guī)超薄切片，透射電鏡觀察。

1.1.2 主要試劑與儀器

甲苯胺藍O、阿爾新藍-8GX、藏紅O購于生工生物工程(上海)股份有限公司；P物質(zhì)(Substance P, SP)抗體購于美國Millipore公司；免疫組化試劑盒購于美國Santa Cruz公司；光學顯微鏡：Olympus-BX51；彩色病理圖文分析系統(tǒng)：HPIAS-2000。

1.2 實驗方法

1.2.1 組織化學染色

組織取材后固定于Bouin’s固定液24～48 h，常規(guī)石蠟切片，脫蠟至水，分別行甲苯胺藍染色和阿爾新藍-藏紅染色。0.25%甲苯胺藍染色1 min，稍水洗，0.5%冰醋酸分化，顯微鏡下控制，直至顆粒明顯、背景清晰，蒸餾水沖洗；0.5%阿爾新藍的3%冰醋酸溶液染色40 min，PBS沖洗后，0.25%藏紅的鹽酸溶液復染1 min，PBS沖洗。酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固。

1.2.2 免疫組織化學染色

采用免疫組織化學ABC法進行染色。取皮膚、脾臟組織固定于4%中性緩沖甲醛溶液，常規(guī)石蠟切片，脫蠟至水，3%甲醇-H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，pH 6.0枸櫞酸鹽緩沖液高壓抗原修復(120℃, 5 min)，0.5% TritonX-100細胞膜打孔，BSA封閉30 min，1∶100稀釋的SP抗體4℃過夜，0.5%二抗、ABC復合物各37℃孵育30 min，DAB室溫顯色，鏡下嚴格控制，陽性部位達到最強顯色而背景無色時終止，蘇木素復染后脫水、透明、封固，顯微鏡下觀察并拍照。PBS代替一抗作為陰性對照。

1.2.3 電鏡切片染色

取皮膚組織立即投入2.5%磷酸緩沖戊二醛溶液預固定，1%鋨酸溶液后固定，常規(guī)電鏡脫水、包埋、固化，LKB-1型超薄切片機切片50～60 nm，3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，Phlips CM-120透射電鏡觀察，拍片。

1.2.4 MC計數(shù)及形態(tài)學參數(shù)分析

在甲苯胺藍染色下對MC進行計數(shù)和形態(tài)學分析。對每只動物個體，連續(xù)隨機計數(shù)10個高倍視野(×400)內(nèi)MC數(shù)，取其平均值代表MC密度，對每種動物雌雄個體分別計數(shù)。使用彩色病理圖像分析軟件，分析MC面積、等效直徑、核質(zhì)比(細胞核在細胞中所占比例)和胞質(zhì)灰度等參數(shù)。

1.2.5 統(tǒng)計分析

2 結果

2.1 HE染色

鏡下觀察結果顯示，六種實驗動物皮膚、肺臟、乙狀結腸和脾臟等4種組織的形態(tài)層次清晰，結構完整，均未觀察到變性、炎癥、增生及壞死等異常病理改變，為正常組織，可用于組織化學、免疫組化染色及電鏡觀察。

2.2 甲苯胺藍染色

皮膚組織中，六種動物MC分布于真皮層和皮下組織，表皮層無分布，多見于血管、淋巴管、毛囊、皮脂腺周圍，胞質(zhì)內(nèi)充滿紫紅色粗大的異染顆粒，顆粒密集，有時占據(jù)整個細胞。小鼠MC體積較大，形態(tài)極不規(guī)則，可見長的細胞突起，且?？梢娒擃w粒形態(tài)的MC在真皮層及皮下組織中均勻分布。與小鼠相比，大鼠MC體積較小，形態(tài)較規(guī)則，有較大的淡藍染的細胞核及亮點樣細胞核，真皮層中分布較少，皮下組織中較多。豚鼠MC有短的細胞突起，在真皮層淺層較多，散在或串珠樣分布。兔MC多為圓形或卵圓形，呈局部密集狀分布，其他區(qū)域密度低，只見個別散在的MC。犬和猴MC多聚集或散在分布于真皮層，皮下組織中分布較少，犬MC體積小而胞核大，猴MC體積較大，細胞邊界不清(圖1，彩插8)。

肺組織中，六種動物MC主要分布于小葉間支氣管、終末細支氣管以及血管、淋巴組織周邊，少量分布于肺間隔。六種動物的MC形態(tài)均可見圓形、橢圓形、梭形、三角形和不規(guī)則形態(tài)，胞質(zhì)被染成紫紅色或藍紫色，胞核呈淡藍色或不著色。小鼠MC形態(tài)最不規(guī)則，個別細胞可見短棒狀突起，胞核較大，似空泡狀，位于細胞中央。大鼠MC胞質(zhì)著深染的紫紅色，胞核淡藍染或亮點狀位于細胞中央或偏于一側。豚鼠與兔的MC胞質(zhì)淡染，部分MC著色偏藍，呈藍紫色，細胞邊界不清，豚鼠MC主要分布在氣管、血管周圍，肺間隔中較少見到，而兔MC在肺間隔中分布較多。犬與猴的MC在肺臟中廣泛分布，肺間隔中也較多見，犬的MC中可見巨大的細胞核，著淡藍色，猴的MC形態(tài)較規(guī)則，胞核大小不一(圖2，彩插8)。

乙狀結腸中，六種動物MC主要見于黏膜固有層和黏膜下層，個別動物尚可見于肌層，犬和猴在漿膜層中亦可觀察到MC，MC多沿血管、淋巴分布，或簇集成群，或排列成行，或單個散在出現(xiàn)。小鼠MC多小而圓，胞質(zhì)為深染的藍紫色，在黏膜固有層分布較多，黏膜下層分布不顯著。大鼠MC胞質(zhì)為深染的紫紅色或藍色，固有層中較少分布，多見于黏膜下層。豚鼠MC分布于固有層、黏膜下層，胞質(zhì)深藍染。兔MC形態(tài)似小鼠，胞質(zhì)染藍紫色，著色淡，在固有層中數(shù)量顯著，黏膜下層分布較少，肌層偶見有分布。犬和猴的MC在黏膜固有層、黏膜下層、肌層和漿膜層均可見分布，胞質(zhì)著紫紅色或深藍色。猴MC還可見于漿膜下層(圖3，彩插9)。

脾臟內(nèi)，MC主要分布于邊緣區(qū)、紅髓、被膜下與小梁周圍，聚集呈簇，紅髓內(nèi)可見圍繞脾血竇分布的MC，動脈周圍淋巴鞘中偶見有MC分布，白髓淋巴小結中無MC。小鼠和兔MC形態(tài)較規(guī)則，呈圓形或橢圓形。小鼠MC胞質(zhì)呈深染的紫紅色，體積大的細胞邊界不清，胞核淡藍染或亮點狀。兔MC胞質(zhì)著藍紫色，胞核位于細胞中央。犬MC形態(tài)多樣，有的可見長短不一的突起，主要分布在邊緣區(qū)。猴MC胞質(zhì)被染成較淡的藍紫色，胞核較大，形態(tài)與分布同犬。在該甲苯胺藍染色方法下，未觀察到大鼠和豚鼠的脾臟MC(圖4，彩插9)。

2.3 阿爾新藍-藏紅(Alcian blue-safranin O, AB-S)染色

AB-S染色顯示MC在皮膚、肺臟、乙狀結腸、脾臟中的分布位置與甲苯胺藍染色結果相同。在小鼠、大鼠、豚鼠和兔的皮膚中可見藍染、紅染和紅藍間染的MC，犬、猴的皮膚中僅觀察到藍染的MC。肺組織內(nèi)，小鼠、大鼠MC呈藍染、紅藍間染、紅染三種，豚鼠、兔、犬、猴僅觀察到到阿爾新藍陽性的MC。脾臟與乙狀結腸內(nèi)，六種動物的MC均只見藍染(圖5，彩插9)。

2.4 SP免疫組化

經(jīng)免疫組化染色的組織中，可見MC呈SP免疫反應性。細胞內(nèi)陽性反應顆粒清晰，呈棕褐色，有時可見陽性顆粒充滿整個細胞。其形態(tài)大小及分布特點與甲苯胺藍染色基本一致。非SP陽性反應細胞為蘇木素藍染。小鼠皮膚中可見SP免疫反應陽性神經(jīng)纖維，行走于MC附近，與MC鄰接(圖6a)。而犬脾臟中未見SP免疫反應陽性神經(jīng)纖維(圖6b)。對照組無陽性顯色(見圖6，彩插10)。

2.5 皮膚MC電鏡觀察

透射電鏡下，小鼠、豚鼠、兔、犬和猴的皮膚MC均呈現(xiàn)橢圓形、梭形、狹長的條形或不規(guī)則的多邊形。細胞表面可見短的偽足樣突起。胞核多為腎形，位于細胞中央或偏于一側，核仁明顯，均可見常染色質(zhì)和異染色質(zhì)，異染色質(zhì)貼附于核膜內(nèi)側。胞質(zhì)內(nèi)含少量線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、游離核糖體及豐富的細胞骨架成分，除此之外可見數(shù)量不等、形態(tài)不一的胞質(zhì)顆粒，顆粒有單位膜包裹。

小鼠MC胞質(zhì)顆粒多呈圓形、橢圓形，少數(shù)呈短棒狀或不規(guī)則形態(tài)。顆?；|(zhì)的電子密度均勻，未見特殊的亞微結構。根據(jù)顆粒電子密度的差異，小鼠皮膚MC可分為高電子密度、中等電子密度及低電子密度的均質(zhì)狀顆粒，低電子密度顆粒外的單位膜清晰可見(圖7a)。豚鼠MC胞質(zhì)顆粒形態(tài)同小鼠。顆?；|(zhì)呈絨毛狀分布于顆粒內(nèi)或呈斑狀偏于顆粒一側，也可見電子密度均勻的均質(zhì)狀顆粒，但個數(shù)極少(圖7b)。兔MC顆粒多呈圓形，少部分呈橢圓形，顆粒大小差別顯著。觀察到斑狀顆粒、低電子密度的均質(zhì)狀顆粒、空泡狀顆粒(圖7c)。犬MC顆粒呈現(xiàn)圓形、橢圓形，少數(shù)為不規(guī)則形態(tài)。顆粒基質(zhì)呈現(xiàn)多種形態(tài)，除了有電子密度不等的均質(zhì)狀顆粒外，仍觀察到多種特殊的顆粒亞微結構。如空泡狀顆粒；同心圓狀顆粒，其形態(tài)為高密度的圓形或橢圓形基質(zhì)襯托在低密度均質(zhì)中央；絨毛狀顆粒；沙礫狀顆粒以及斑狀顆粒(圖7d)。猴MC的顆粒形態(tài)與犬類似，但顆粒的亞微結構不如犬的復雜。將猴皮膚MC的胞質(zhì)顆粒分為4種類型：I型為均質(zhì)狀顆粒，II型為沙礫狀顆粒，III型為結晶狀顆粒，IV型為空泡狀顆粒(圖7e)。

注：a、b、c、d、e分別為小鼠、豚鼠、兔、犬和猴皮膚MC超微結構。

2.6 MC計數(shù)比較

六種實驗動物MC的數(shù)量在皮膚、肺臟及乙狀結腸中差異均有顯著性(P<0.05)，皮膚中小鼠和大鼠MC數(shù)量較多，肺組織中犬和猴MC數(shù)量較多，乙狀結腸中兔、犬和猴MC數(shù)量較多。小鼠、兔、犬和猴脾臟MC數(shù)量差異有顯著性(P<0.05)，犬MC數(shù)量較多。雌性犬皮膚MC數(shù)量多于雄性(P<0.05)，而肺組織中雄性犬MC數(shù)量多于雌性(P<0.01)，其余動物雌雄個體間差異無顯著性(P>0.05)。

2.7 MC形態(tài)學參數(shù)比較

六種動物之間，皮膚、肺臟和乙狀結腸組織中MC的面積、等效直徑、核質(zhì)比和胞質(zhì)灰度差異均有顯著性(P<0.05)，小鼠、兔、犬和猴的脾臟MC面積、核質(zhì)比和胞質(zhì)灰度差異均有顯著性(P<0.05)，等效直徑則無差異(表1～4)。

表1 六種實驗動物皮膚MC參數(shù)分析±s)

表2 六種實驗動物乙狀結腸MC參數(shù)分析±s)

表3 六種實驗動物肺臟MC參數(shù)分析±s)

表4 六種實驗動物脾臟MC參數(shù)分析±s)

3 討論

MC胞質(zhì)顆粒富含多種生物活性介質(zhì)和細胞因子[3]。顆粒內(nèi)的組胺、肝素對堿性染料甲苯胺藍具有異染性，可被染成藍紫色，從而與周圍細胞、組織區(qū)分。本實驗甲苯胺藍染色結果顯示，MC在各種動物的每種組織中均存在形態(tài)學差異，但未觀察到大鼠和豚鼠的脾臟MC，使用改良甲苯胺藍染色法，或可增加MC的染出率。目前國內(nèi)尚未有關于甲苯胺藍染色效果差異性的報道，本實驗發(fā)現(xiàn)六種動物乙狀結腸中均可見數(shù)量不等的胞質(zhì)呈深藍染的MC，與其他部位胞質(zhì)著紫紅色的MC不同，表明甲苯胺藍對于不同部位MC的著色有差別。不同動物的MC密度差別顯著，同種動物雌雄個體間無差別，僅在犬的皮膚和肺臟中發(fā)現(xiàn)雌雄差異，由于統(tǒng)計個體較少，對此差異故暫不能下定論。本實驗對象均為成年動物，年齡差異對MC的異質(zhì)性是否有影響，仍需進一步實驗研究。

根據(jù)顆粒介質(zhì)種類的不同，動物MC分為結締組織MC(CTMC)和黏膜MC(MMC)[2]。使用AB-S染色法能夠區(qū)分含有不同顆粒種類的MC，藏紅陽性者(紅染)為顆粒內(nèi)酸性黏多糖含硫量較高、以分泌肝素為主的成熟MC, Alcian藍陽性者(藍染)則為分泌組胺為主的未成熟的MC[4]。本實驗在小鼠、大鼠、豚鼠和兔的皮膚MC，小鼠和大鼠的肺臟MC中觀察到紅染和紅藍間染的MC，表明在這些組織中存在以分泌肝素為主的MC，其他組織中則僅見以分泌組胺為主的阿爾新藍陽性MC。雖然目前對AB-S染色技術在組織化學評價方面尚有爭議，但本實驗中相同條件下不同組織MC呈現(xiàn)著色差異，亦可在一定程度上說明MC顆粒介質(zhì)的種類是存在差異的。有研究發(fā)現(xiàn)，病理狀態(tài)下MC的著色性發(fā)生改變：小鼠急性缺氧致肺損傷的模型中，隨著缺氧時間的延長，肺組織內(nèi)紅染、紅藍混染顆粒逐漸減少，藍染顆粒逐漸增多[5]。

透射電鏡觀察顯示豚鼠、犬和猴的皮膚MC顆粒均有特殊亞微結構。結果證實不同動物皮膚MC顆粒介質(zhì)種類的確存在差異，但每種結構所表示的介質(zhì)性質(zhì)及意義，則仍需進一步研究。人MC胞質(zhì)顆粒有旋渦狀、顆粒狀和結晶狀特殊結構[6]，本實驗在猴MC胞質(zhì)顆粒內(nèi)發(fā)現(xiàn)了和人相似的結晶狀結構，提示猴與人MC在介質(zhì)種類及功能上可能存在相似性。

SP免疫組化結果顯示，在小鼠皮膚可見充滿SP免疫陽性顆粒的MC及SP陽性免疫反應神經(jīng)纖維，兩者在位置上構成關聯(lián)，位于真皮層淺層，與以往的報道相同[7]。在犬MC內(nèi)可見SP免疫陽性的MC。神經(jīng)纖維釋放SP，以旁分泌的方式作用于與之相鄰或形成突觸連接的MC，引起MC脫顆粒，釋放組胺等炎性介質(zhì)[8]，使血管擴張、血漿溢出以及皮膚局部紅腫、瘙癢，而組胺反作用于感覺神經(jīng)，促使其形成SP經(jīng)軸突反射由另一神經(jīng)末梢釋放[9]，SP亦作為痛覺傳入遞質(zhì)向中樞傳入痛覺信息。與此同時MC釋放SP，一方面作用于MC自身，另一方面刺激淋巴細胞和抗體生成，引起局部免疫反應[10]。含SP的MC、神經(jīng)纖維以及兩者的形態(tài)聯(lián)系，與增生性瘢痕[11]、特應性皮炎[12]、銀屑病[13]等皮膚性疾病的病理發(fā)展相關。脾臟是免疫系統(tǒng)重要的器官之一，富含B淋巴細胞和T淋巴細胞，與甲苯胺藍染色相比，犬脾臟內(nèi)的MC大部分呈SP免疫反應陽性，SP(+)MC受神經(jīng)調(diào)控脫顆粒釋放SP，促進周圍組織中淋巴細胞生成，對于免疫調(diào)節(jié)、維持宿主免疫防御和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有重要意義。

綜上所述，本實驗通過組織學、免疫學、細胞生物學和形態(tài)參數(shù)分析等指標，在國內(nèi)首次系統(tǒng)比較了六種常用實驗動物皮膚、肺臟、乙狀結腸和脾臟中MC的組織形態(tài)學特點，結果顯示并證實了MC在不同動物同一組織及同一種不同組織中存在明顯的異質(zhì)性。實驗結果對于生命科學領域中開展人類動物模型的相關實驗研究，提供MC功能和組織學參考資料。

(本文圖1～6見彩插8,9,10)。

[1] 莊玉, 呼格吉樂圖, 趙風華, 等.肥大細胞研究概述 [J].動物醫(yī)學研究進展.2011, 32(9): 109-112.

[2] Heib V, Becker M, Taube C, et al.Advances in the understanding of mast cell function [J].Br J Hematol, 2008, 142(5): 683-694.

[3] Franceschini B, Ceva-Grimaldi G, Russo C, et al.The complex functions of mast cells in chronic human liver diseases [J].Dig Dis Sci.2006, 51: 2248-2256.

[4] 呼格吉樂圖, 蘇布達, 王志, 等.肥大細胞的組織化學與超微結構異質(zhì)性 [J].細胞生物學雜志.2007, 29: 840-844.

[5] 于洪川, 魏智清, 張振漢, 等.小鼠急性缺氧后肺內(nèi)MC的變化 [J].寧夏大學學報(自然科學版).2007, 28(3): 249-252.

[6] 姚紅艷, 李秀富, 李詩舉, 等.小鼠空腸肥大細胞組織化學及超微結構研究 [J].動物醫(yī)學進展.2010, 31(1): 41-43.

[7] Li WW, Guo TZ, Liang DY, et al.Substance P signaling controls mast cell activation, degranulation, and nociceptive sensitization in a rat fracture model of complex regional pain syndrome [J].Anesthesiology.2012, 116(4): 882-895.

[8] Buhner S, Schemann M.Mast cell-nerve axis with a focus on the human gut [J].Biochim Biophys Acta.2012, 1822: 85-92.

[9] Harvima IT, Nilsson G.Stress, the neuroendocrine system and mast cells: current understanding of their role in psoriasis [J].Expert Rev Clin Immunol.2012, 8(3):235-241.

[10] Pongor é; Altdorfer K; Fehér E.Colocalization of substance P with tumor necrosis factor-α in the lymphocytes and mast cells in gastritis in experimental rats [J].Inflammat Res.2011, 60: 163-168.

[11] 陳亮, 流沙, 李世榮, 等.P物質(zhì)對人增生性瘢痕組織塊中組胺釋放的影響 [J].中華燒傷雜志.2006, 22(3): 192-194.

[12] Choi JK, Kim SH.Inhibitory effect of galangin on atopic dermatitis-like skin lesions[J].Food Chem Toxicol.2014, 68:135-141.

[13] Theoharides TC, Zhang B, Kempuraj D, et al.IL-33 augments substance P-induced VEGF secretion from human mast cells and is increased in psoriatic skin [J].Proc Natl Acad Sci U S A.2010, 107(9): 4448-4453.