王配，霍金龍，王淑燕，潘偉榮，查星琴，施晨，曾養(yǎng)志

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 云南省版納微型豬近交系重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650201；

2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，昆明 650201)

版納微型豬近交系(BMI)從1980年建系以來(lái)，一直采用全同胞和親子交配的高度近交加嚴(yán)格選擇的方法進(jìn)行培育，克服了早期世代中存在的嚴(yán)重近交衰退，于2003年進(jìn)入20世代，達(dá)到了國(guó)際和國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物委員會(huì)對(duì)近交系培育的標(biāo)準(zhǔn)，成為世界上第一個(gè)培育成功的大型哺乳動(dòng)物近交系。2005年通過(guò)了由遺傳學(xué)、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)、醫(yī)學(xué)、動(dòng)物育種學(xué)等專家組成的鑒定委員會(huì)的成果鑒定。其解剖、發(fā)育、生理、病理、疾病發(fā)生等方面與人類極為相似，是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的理想實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[1-4]。版納微型豬近交系自建系以來(lái)有多個(gè)亞系斷代，通過(guò)大量觀察、統(tǒng)計(jì)以及基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，繁殖力較差的亞系其公豬精液品質(zhì)相對(duì)較差、畸形率較高。據(jù)報(bào)道雄性動(dòng)物不育多由生精障礙造成[5]，而精子發(fā)生又是一個(gè)復(fù)雜的細(xì)胞分化過(guò)程，受生殖細(xì)胞的基因組控制[6-7]，有許多的基因參與調(diào)控，這些基因構(gòu)成了一個(gè)有機(jī)的空間網(wǎng)絡(luò)，每個(gè)基因都在其中發(fā)揮著特定的功能[8-9]。挖掘、尋找、鑒定生精障礙相關(guān)基因，了解雄性不育的遺傳病因，闡明發(fā)病機(jī)制是解決版納微型豬近交系繁殖障礙的有效途徑。

睪丸發(fā)育相關(guān)蛋白(testis development-related protein, TDRP)是一種新型核因子，于2010年首次從人睪丸cDNA文庫(kù)中克隆獲得[10]，最初稱為染色體8開(kāi)放閱讀框42(chromosome 8 open reading frame 42, C8orf42)。TDRP有2個(gè)完全不同的轉(zhuǎn)錄子，轉(zhuǎn)錄子1(TDRP1)含有3個(gè)外顯子，ORF長(zhǎng)549 bp，編碼183個(gè)氨基酸；轉(zhuǎn)錄子2(TDRP2)含有4個(gè)外顯子，ORF長(zhǎng)594 bp，編碼198個(gè)氨基酸[10]。人和鼠的Northern blot、免疫組化和組織Western blot研究結(jié)果表明TDRP1 mRNA和蛋白質(zhì)都主要在成年個(gè)體睪丸組織的生精細(xì)胞中表達(dá)，尤其在精母細(xì)胞中表達(dá)量最高，并且其表達(dá)還受發(fā)育調(diào)控，隨著發(fā)育成熟，TDRP1的表達(dá)量逐漸升高；且TDRP1在生精功能障礙所致的男性不育患者睪丸組織中的表達(dá)明顯低于生精功能正常的睪丸組織，說(shuō)明TDRP1在維持哺乳動(dòng)物精子正常功能方面具有重要作用[10]。目前關(guān)于TDRP1基因的研究相對(duì)較少，在NCBI Pubmed數(shù)據(jù)庫(kù)中，只能搜索到幾篇文獻(xiàn)，有必要深入研究；另外鑒于其在人類和嚙齒類動(dòng)物精子發(fā)生方面取得的進(jìn)展，認(rèn)為其可能與BMI公豬的繁殖力有一定的相關(guān)性，故本研究應(yīng)用RT-PCR方法從不育和可育BMI公豬睪丸組織中克隆TDRP1基因，分析其序列特征、檢測(cè)其mRNA表達(dá)特性并預(yù)測(cè)其蛋白質(zhì)功能，為下一步以BMI為動(dòng)物模型研究TDRP1的功能和闡明BMI公豬生精障礙機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

以成年(15月齡)的BMI不育公豬為實(shí)驗(yàn)材料，并以成年(15月齡)的BMI可育公豬為對(duì)照，活體去勢(shì)采集睪丸，液氮速凍，-80℃超低溫冰箱保存以備RNA提取，用于克隆目的基因和分析其與BMI公豬繁殖力的關(guān)系。

選取正常的BMI可育公豬(12月齡)1頭。屠宰后采集心、肝、脾、肺、腎、胸腺、淋巴結(jié)、皮膚、十二指腸、胃、大腦、小腦、睪丸、附睪、精囊腺、前列腺和尿道球腺等17種組織，提取RNA,用于目的基因多組織表達(dá)譜研究。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和cDNA合成

利用TaKaRa公司的RNAiso Plus分別提取各種組織的總RNA，參考Invitrogen公司的逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV試劑盒操作說(shuō)明將組織總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，具體步驟可參照說(shuō)明書和文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。

1.2.2 設(shè)計(jì)、合成PCR引物

利用NCBI已公布的豬的TDRP1基因(登錄號(hào)：NM_001198925)序列，綜合應(yīng)用Primer Premier 5.0和Oligo 6軟件設(shè)計(jì)特異性引物(見(jiàn)表1)，由上海生工生物工程有限公司合成，進(jìn)行BMITDRP1基因的編碼區(qū)序列擴(kuò)增。以持家基因GAPDH或18S為內(nèi)參，根據(jù)文獻(xiàn)引物擴(kuò)增[12-13]，用于分析目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 TDRP1和內(nèi)參基因的PCR引物信息和擴(kuò)增程序

1.2.3 PCR擴(kuò)增

利用TakaRa的ExTaq酶進(jìn)行擴(kuò)增，模板為睪丸組織RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA，PCR反應(yīng)體系為：12.5 μL 2×GC buffer I，2 μL的稀釋后的25 ng/μL的cDNA，10 μmol/L 的正、反向引物各0.5 μL，0.25 μL的5 U/μL的ExTaq酶，加水補(bǔ)足至25 μL。擴(kuò)增程序見(jiàn)表1。PCR產(chǎn)物利用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像儀照相，產(chǎn)物送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)序。

1.2.4 TDRP1蛋白生物信息學(xué)分析

根據(jù)所獲得的BMITDRP1基因cDNA全序列預(yù)測(cè)其氨基酸序列，參考Qin等[14]描述的方法進(jìn)行TDRP1蛋白分子量(Mw)、等電點(diǎn)(pI)、信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位和二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)。蛋白磷酸化位點(diǎn)使用NetPhos2.0程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)在線預(yù)測(cè)，亮氨酸富集的核輸出信號(hào)使用NetNES1.1程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNES/)在線預(yù)測(cè)。

在Swiss-Prot中搜索得到人、恒河猴、大鼠和小鼠的TDRP1的氨基酸序列(NP_778250、NP_001252913、NP_001094261和NP_776105)與BMI的TDRP1的氨基酸序列進(jìn)行同源性和序列比對(duì)分析，并進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，其中同源性分析采用DNASTAR軟件中的MegAlign程序，序列比對(duì)分析采用ClustalX 1.83和DNAMAN軟件進(jìn)行，分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)利用MEGA5.2軟件構(gòu)建。

1.2.5TDRP1表達(dá)分析

用TDRP1 F/R引物檢測(cè)不育和可育公豬睪丸的基因表達(dá)水平和多組織表達(dá)譜，其中GAPDH作為不育和可育公豬睪丸組織表達(dá)水平檢測(cè)的內(nèi)參，18S作為多組織表達(dá)譜的內(nèi)參。PCR擴(kuò)增參照1.2.3，在檢測(cè)TDRP1基因的多組織表達(dá)譜時(shí)，PCR為32個(gè)循環(huán)，18S為30個(gè)循環(huán)。而在分析TDRP1在不育和可育公豬睪丸組織的差異性表達(dá)時(shí)，進(jìn)行了循環(huán)數(shù)優(yōu)化，最終GAPDH和TDRP1的PCR擴(kuò)增循環(huán)數(shù)分別為28和30。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后利用Quantity One軟件測(cè)定每個(gè)條帶灰度值，以18S或GAPDH為參照，進(jìn)行比較獲得相對(duì)表達(dá)水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 TDRP1基因在不育和可育公豬睪丸中表達(dá)水平分析

從活體去勢(shì)采集到的BMI不育和可育公豬睪丸組織中提取總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，以cDNA為模板，以TDRP1 F/R為引物擴(kuò)增得到了680 bp的條帶，與預(yù)計(jì)大小相符，見(jiàn)圖1。TDRP1的表達(dá)量用GAPDH的表達(dá)量校正后獲得相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果，以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，TDRP1基因在不育公豬和可育公豬個(gè)體的睪丸組織中mRNA表達(dá)水平接近，差異無(wú)顯著性(P>0.05)。

2.2 TDRP1 cDNA序列及蛋白質(zhì)理化性質(zhì)預(yù)測(cè)結(jié)果

通過(guò)PCR產(chǎn)物原液測(cè)序，得到了一條680 bp的核苷酸序列，發(fā)現(xiàn)TDRP1基因序列在BMI不育和可育公豬個(gè)體間完全一致，無(wú)變異位點(diǎn)；但與參考序列NM_001198925相比，在編碼區(qū)有兩處同義突變，分別為c.33(C> G)和c.348(C > T)，見(jiàn)圖2。此序列已提交GenBank，基因登錄號(hào)為KJ186786，其中包含了561 bp的開(kāi)放閱讀框、87 bp 5′非編碼區(qū)和32 bp 3′非編碼區(qū)，編碼186個(gè)氨基酸，如圖2所示。BMI TDRP1蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為20.49 ×103，等電點(diǎn)為5.86，無(wú)信號(hào)肽，存在1個(gè)亮氨酸富集的核輸出信號(hào)(75AA-81AA)(圖2和3)，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示該蛋白位于細(xì)胞核的概率是94.1%。

注：M.DL2000分子量標(biāo)準(zhǔn)；1.不育公豬；2.可育公豬。

注：ATG.起始密碼子；*.終止密碼子；上一行大寫字母為核酸序列，對(duì)應(yīng)的下一行為氨基酸序列；小寫字母為5′和3′側(cè)翼序列；方框?yàn)橐镄蛄校浑p下劃線為亮氨酸富集的核輸出信號(hào)；▲為突變堿基(相對(duì)參考序列：NM_001198925)。

2.3 TDRP1蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

通過(guò)SOPMA程序預(yù)測(cè)的BMI TDRP1蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中含17 AA的延伸鏈結(jié)構(gòu)(9.14%)，30 AA的β-轉(zhuǎn)角(6.13%)，44 AA的α-螺旋(23.66%)，95 AA的無(wú)規(guī)則卷曲(51.08%)(圖4)。

2.4 TDRP1蛋白質(zhì)同源性分析

用豬的TDRP1氨基酸序列在Swiss-Prot中進(jìn)行同源性搜索，獲得了人、恒河猴、小鼠和大鼠等動(dòng)物的TDRP1氨基酸序列，序列比對(duì)分析表明，豬TDRP1與人TDRP1的相似性為82.7%，與恒河猴的TDRP1相似性為83.2%，與小鼠的TDRP1相似性為74.0%，與大鼠的TDRP1相似性為73.5%(表2)。哺乳動(dòng)物TDRP1氨基端和羧基末端均相對(duì)保守，中間某些區(qū)域變化較大(序列比對(duì)見(jiàn)圖5)。

2.5 TDRP1分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

利用MEGA5.2構(gòu)建了BMI豬、人、恒河猴、小鼠和大鼠TDRP1氨基酸的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(見(jiàn)圖6)，小鼠和大鼠聚為一支，人和恒河猴聚為一支，豬為另一支，但豬與靈長(zhǎng)類比與嚙齒類更近。

2.6 TDRP1蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

通過(guò)NetPhos2.0軟件在線預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)TDRP1包含一些保守的蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)，包括14個(gè)絲氨酸磷酸位點(diǎn)，1個(gè)蘇氨酸磷酸位點(diǎn)和1個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，見(jiàn)圖7。結(jié)合不同物種的氨基酸比對(duì)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)8個(gè)絲氨酸(67、70、87、144、149、156、160、169和174位)和1個(gè)酪氨酸(147位)磷酸化位點(diǎn)高度保守，見(jiàn)圖5和圖7。

2.7 TDRP1多組織表達(dá)譜分析結(jié)果

以看家基因18S為內(nèi)參，利用RT-PCR方法檢測(cè)TDRP1基因在版納微型豬近交系正常公豬17個(gè)組織(包括心、肝、脾、肺、腎、胸腺、淋巴結(jié)、皮膚、十二指腸、胃、大腦、小腦、睪丸、附睪、精囊腺、前列腺和尿道球腺)的轉(zhuǎn)錄水平，多組織表達(dá)譜分析表明BMITDRP1基因在各組織中存在明顯的差異表達(dá)現(xiàn)象(圖8)，在精囊腺和前列腺中高表達(dá)，在睪丸和小腦中中度表達(dá)，在大腦和腎臟中低表達(dá)，在其余11種組織中不表達(dá)。

圖3 NetNES1.1程序預(yù)測(cè)的TDRP1蛋白亮氨酸富集的核輸出信號(hào)

注：分別用最長(zhǎng)、次長(zhǎng)、第三長(zhǎng)和最短的垂直線表示α-螺旋、延伸鏈結(jié)構(gòu)、β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲。

表2 BMI和其他4個(gè)物種TDRP1氨基酸序列的同源性分析

注：保守的絲氨酸磷酸位點(diǎn)用空五角形標(biāo)記(☆)，保守的酪氨酸磷酸位點(diǎn)用實(shí)五角形標(biāo)記(★)。

圖6 BMI豬、人、恒河猴、小鼠和大鼠的TDRP1氨基酸序列構(gòu)建的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

圖7 NetPhos2.0程序預(yù)測(cè)的豬TDRP1蛋白磷酸化位點(diǎn)

注：M.DL2000 分子量標(biāo)準(zhǔn)，1.心，2.肝，3.脾，4.肺，5.腎，6.胸腺，7.淋巴結(jié)，8.皮膚，9.十二指腸，10.胃，11.大腦，12.小腦，13.睪丸，14.附睪，15.精囊腺，16.前列腺，17.尿道球腺。

3 討論

本研究以TDRP1為公豬繁殖性狀的候選基因，分析其在BMI不育和可育公豬中的序列和mRNA表達(dá)水平的差異性，并進(jìn)一步研究了該基因在近交系公豬重要組織中的表達(dá)規(guī)律。通過(guò)分析發(fā)現(xiàn)，BMI不育和可育公豬TDRP1基因編碼序列完全一致，但和參考序列NM_001198925相比，在編碼區(qū)有2處同義突變，是一種新的單倍型，已提交GenBank，基因登錄號(hào)為KJ186786，對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)登錄號(hào)為AHV91001。由于發(fā)現(xiàn)的SNP位點(diǎn)在不育公豬和可育公豬中都存在；另外，TDRP1基因在不同個(gè)體的睪丸組織中mRNA表達(dá)水平接近，差異無(wú)顯著性；故認(rèn)為TDRP1基因點(diǎn)突變與BMI不育公豬的低繁殖力關(guān)系不大。

以18S為內(nèi)參校正的多組織表達(dá)譜說(shuō)明BMITDRP1基因在各組織中存在明顯的差異表達(dá)現(xiàn)象，在精囊腺和前列腺中高表達(dá)，在睪丸和小腦中中度表達(dá)，在大腦和腎臟中低表達(dá)，在其余11種組織中不表達(dá)，這與TDRP1在約克夏和香豬中研究結(jié)果不太一致[15-16]，但由于在約克夏和香豬沒(méi)有進(jìn)行精囊腺和前列腺TDRP1 mRNA表達(dá)水平的檢測(cè)，所以不能確定是物種還是試驗(yàn)技術(shù)原因造成的差異，需要進(jìn)一步的研究確認(rèn)。人和小鼠的研究認(rèn)為TDRP1發(fā)揮功能的主要部位是睪丸[10]，故關(guān)于TDRP1基因在BMI精囊腺和前列腺高表達(dá)的生物學(xué)意義尚不清楚。

生物信息學(xué)分析顯示BMI TDRP1蛋白無(wú)信號(hào)肽，說(shuō)明它屬于非分泌性蛋白，是在游離的核糖體上合成的，會(huì)直接釋放到細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)中，不需經(jīng)過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體分泌途徑的修飾，只用于構(gòu)成細(xì)胞的自身結(jié)構(gòu)。預(yù)測(cè)BMI TDRP1存在1個(gè)亮氨酸富集的核輸出信號(hào)(NES)，而人和豬的TDRP1蛋白同樣也有1個(gè)亮氨酸富集的核輸出信號(hào)(NES)[10,17]，該信號(hào)的主要功能在于蛋白亞細(xì)胞定位，與精子生成相關(guān)；亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示該蛋白位于細(xì)胞核的概率是94.1%，兩者結(jié)果基本一致。BMI TDRP1氨基酸與人、恒河猴、小鼠和大鼠的氨基酸序列比對(duì)分析表明相似性高于73%，在不同物種間存在較高的同源性。從包括BMI在內(nèi)的5個(gè)物種TDRP1構(gòu)建的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)看，小鼠和大鼠是嚙齒目，聚為一類；人和恒河猴均為靈長(zhǎng)目，聚為一類；豬相對(duì)于嚙齒目，與靈長(zhǎng)目更為接近，與其聚為一大類。獲得的5個(gè)物種TDRP1蛋白質(zhì)序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)與其分類學(xué)地位一致。蛋白質(zhì)磷酸化是調(diào)節(jié)和控制蛋白質(zhì)活力和功能的最基本、最普遍，也是最重要的機(jī)制[18]，預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)了BMI TDRP1存在16個(gè)保守的蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)，其中有8個(gè)絲氨酸和1個(gè)酪氨酸磷酸化位點(diǎn)在哺乳動(dòng)物中高度保守，這些氨基酸基序可能在TDRP1蛋白參與精子發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。

綜上所述，本研究克隆了BMITDRP1基因的cDNA序列，并對(duì)其進(jìn)行了一些必要的功能預(yù)測(cè)，研究了其在不育和可育公豬間序列和mRNA表達(dá)水平的差異性，并進(jìn)行了多組織表達(dá)譜分析。揭示了精囊腺和前列腺是TDRP1基因mRNA表達(dá)最高的部位，且發(fā)現(xiàn)了2處BMI特有的SNP位點(diǎn)，是一種新的單倍型。研究結(jié)果為深入研究TDRP1基因的功能奠定了基礎(chǔ)。

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