梁德，唐晶晶，江曉兵，2，姚珍松，2，張順聰，2，楊志東，2，魏秋實(shí)，崔健超，任輝，沈耿楊，林順鑫

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣州 510405)

糖皮質(zhì)激素在結(jié)締組織病、免疫系統(tǒng)疾病、腎臟疾病、器官移植、哮喘、休克等領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用, 超生理劑量的皮質(zhì)醇對骨組織的發(fā)育、生長有著明顯不利的影響。20世紀(jì)30年代一些美國學(xué)者就對糖皮質(zhì)激素所致的骨質(zhì)疏松(glucocorticoid-induced osteoporosis，GIOP)有了詳細(xì)描述。GIOP[1-3]是臨床常見的繼發(fā)性骨質(zhì)疏松的首要原因，也是骨質(zhì)疏松的第三位原因[4]。GIOP隨著糖皮質(zhì)激素的廣泛應(yīng)用也越來越常見，因此對于 GIOP尋找有效的干預(yù)措施具有重要意義，也因此成為醫(yī)學(xué)界急待解決的課題。在維持激素用量的條件下，作者觀察了相同時(shí)間內(nèi)不同的給藥方法是否可以減少激素對骨密度、骨生物力學(xué)、骨代謝、病理形態(tài)等方面的影響，為臨床運(yùn)用激素的給藥方式提供參考依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級SD大鼠45只，5～7周齡，雄性，體重(200±20)g，購于廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心【SCXK(粵)2013-0020】。實(shí)驗(yàn)在廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施進(jìn)行【SYXK(粵)2010-0092】，飼養(yǎng)溫度(22±3)℃，濕度55%～75%，自然光節(jié)律，并按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道關(guān)懷。

1.2 藥物與儀器

潑尼松(廠家：廣東三才石岐制藥有限公司，批號：國藥準(zhǔn)字H14020327)；生理鹽水(廠家：四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號：N14011602-1)；雙能X線吸收骨密度儀(美國Hologic公司)等。

1.3 動(dòng)物分組與造模

將 SPF級雄性SD大鼠45只隨機(jī)分為正常組、灌胃組、肌內(nèi)注射組(n=15)，其中正常組大鼠作為陰性對照，給予生理鹽水灌胃2 mL/d，灌胃組大鼠給予潑尼松0.5 mg/(kg·d)灌胃;肌內(nèi)注射組大鼠給予潑尼松0.5 mg/ (kg·d)，連續(xù)干預(yù)12周后，將各組大鼠10%利多卡因腹腔注射麻醉處死，取大鼠血清、腰椎骨、股骨，剔除肌內(nèi)和結(jié)締組織，用生理鹽水浸泡的濕紗布包裹，-80℃密封保存，用于骨生物力學(xué)及骨BMD檢測。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 血清β-CTX、PINP水平及椎骨骨密度

取各組大鼠血清測定β-CTX、PINP水平、椎骨采用雙能X線吸收骨密度儀(美國Hologic公司)檢測各組大鼠腰4～6椎體的BMD，采用單位面積內(nèi)的骨礦物質(zhì)含量 (g/cm2)表示。結(jié)果，與正常組相比，灌胃組及肌內(nèi)注射組大鼠中血清β-CTX水平均顯著升高(P<0.05)而PINP水平均顯著降低(P<0.05)，與灌胃組相比，肌內(nèi)注射組大鼠血清β-CTX水平顯著升高(P<0.05)而PINP水平顯著降低(P<0.05)。與正常組相比，灌胃組、肌內(nèi)注射組大鼠椎骨骨密度值均明顯下降(P<0.05)；與灌胃組相比，肌內(nèi)注射組大鼠椎骨骨密度值降低(P<0.05)，見表1。

表1 血清β-CTX、PINP水平及骨密度測定結(jié)果 ± s，n =15)

2.2 生物力學(xué)指標(biāo)

采用三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)：取各組大鼠的左側(cè)股骨，解凍，作為試樣，將其置于微機(jī)控制電子萬能試驗(yàn)機(jī)支座上，跨距20 mm，加載速度1 mm/min。用游標(biāo)卡尺測量股骨中段的長軸、短軸及長短軸方向的壁厚，由載荷形變曲線可以得出最大載荷、斷裂載荷、彈性載荷等數(shù)值。結(jié)果，與正常組相比, 灌胃組及肌內(nèi)注射組大鼠股骨的彈性載荷、最大載荷、斷裂載荷均明顯降低(P<0.05)，肌內(nèi)注射組與灌胃組大鼠的彈性載荷、最大載荷、斷裂載荷相比差異無顯著性(P>0.05)，見表2。

表2 三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)力學(xué)參數(shù)變化 ± s)

2.3 骨組織形態(tài)學(xué)檢測

(采用日本Olympus顯微鏡觀察神經(jīng)根組織的病理改變并攝影)組織切片HE染色顯示12周后，正常組大鼠骨小梁飽滿，形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，骨髓細(xì)胞數(shù)量較多。灌胃組大鼠骨小梁疏松，形態(tài)結(jié)構(gòu)欠完整，造血組織減少，脂肪細(xì)胞較正常大鼠組增多。肌內(nèi)注射組大鼠的骨小梁明顯纖細(xì)疏松，形態(tài)結(jié)構(gòu)斷裂、扭曲，造血組織明顯減少，脂肪組織大量增多(見圖1，彩插14)。

3 討論

目前，糖皮質(zhì)激素性骨質(zhì)疏松 (glucocorticoid-induced osteoporosis, GIOP ) 是繼發(fā)性骨質(zhì)疏松的首要原因，在該疾病病因病理探討及防治上，很多國內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了大量的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)，建立激素性骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型[5]，運(yùn)用各種藥物進(jìn)行干預(yù)，取得了一定的研究進(jìn)展。相關(guān)實(shí)驗(yàn)表明長期服用激素導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的患病率僅次于絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥,為20～40歲人群骨質(zhì)疏松癥最常見原因之一[6-7],然其具體發(fā)病機(jī)制尚不明確。部分學(xué)者認(rèn)為過量的糖皮質(zhì)激素會抑制成骨細(xì)胞前體細(xì)胞的分化和影響成熟成骨細(xì)胞的功能,促進(jìn)成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的凋亡,使骨細(xì)胞數(shù)目減少。糖皮質(zhì)激素的使用時(shí)間及總量是導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的觀點(diǎn)尚存在爭論[8-10]，很多學(xué)者認(rèn)為長期使用糖皮質(zhì)激素為誘發(fā)骨質(zhì)疏松的重要因素，然而Hall和Lane等[11-12]的研究表明,曾經(jīng)使用過糖皮質(zhì)激素的患者停用一段時(shí)間后與未使用過糖皮質(zhì)激素者BMD相同。這說明骨量的丟失是可逆的,停用糖皮質(zhì)激素后BMD會逐漸增加。目前大多數(shù)爭議都圍繞在糖皮質(zhì)激素的使用時(shí)間和劑量對骨密度及其他相關(guān)指標(biāo)的研究上，而對于不同途徑的給藥方式對骨密度、骨生物力學(xué)、骨代謝方面的影響的研究尚不多見。由于大多數(shù)患者因不同的急慢性疾病而需要長時(shí)間服用激素,很多患者達(dá)到維持量后減藥困難,找到一種合理的激素?cái)z取方式可能會減少對骨密度、骨生物力學(xué)、骨代謝的影響，從而減少骨質(zhì)疏松的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。吳天秀[13]也通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)長期使用高劑量糖皮質(zhì)激素，不論是每日給藥還是隔日給藥均可以引起大鼠骨量減少，發(fā)生骨質(zhì)疏松。與此同時(shí)，骨質(zhì)疏松除了骨量減少的因素外 , 還與骨結(jié)構(gòu)因素和骨內(nèi)微損傷的數(shù)量有關(guān)，骨微損傷存在于活體骨中并影響骨組織微結(jié)構(gòu)性質(zhì)和功能。骨小梁退行性改變與顯微骨折導(dǎo)致了骨小梁結(jié)構(gòu)強(qiáng)度下降。因此骨顯微結(jié)構(gòu)的改變可以更直接地反映骨質(zhì)疏松情況。近年來，國內(nèi)外很多研究顯示骨形成標(biāo)志物I型前膠原氨基端前肽[14](procollagen type I N-propeptide，PINP)及骨吸收標(biāo)志物I型膠原羥基端肽[15](C-terminal cross-linking telopeptide of type I collagen，β-CTX)靈敏度、特異性、準(zhǔn)確性均較高，是評價(jià)骨代謝的良好指標(biāo)。測定血清PINP、β-CTX的含量不僅對了解骨代謝變化,觀察成骨細(xì)胞的功能狀態(tài)和破骨細(xì)胞的活性具有重要意義,而且為骨質(zhì)疏松的診斷及治療提供了有價(jià)值的指標(biāo)。Engvall等[16]通過一項(xiàng)臨床研究發(fā)現(xiàn)長期服用低劑量的潑尼松龍對早期內(nèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者會導(dǎo)致骨密度快速的降低，PINP、β-CTX的含量都降低，但PINP下降更明顯和快速，反映成骨能力顯著降低，從而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的產(chǎn)生。

本實(shí)驗(yàn)通過不同的途徑給予潑尼松，并于12 周時(shí)測定大鼠相關(guān)指標(biāo)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，無論是口服或肌內(nèi)注射潑尼松都會導(dǎo)致大鼠骨密度降低，且肌內(nèi)注射組大鼠椎骨骨密度降低最顯著。這表明肌內(nèi)注射潑尼松的給藥方法能更快的降低骨密度，從而可能更快誘發(fā)骨質(zhì)疏松。骨生物力學(xué)指標(biāo)是骨量、形態(tài)、結(jié)構(gòu)和完整程度的綜合體現(xiàn) ,能直接反映骨強(qiáng)度和抗骨折能力[17-18],已成為評價(jià)骨骼特性和抗骨質(zhì)疏松藥物療效不可缺少的指標(biāo)生物力學(xué)特性包括骨的材料特性和結(jié)構(gòu)特性兩個(gè)方面。由于結(jié)構(gòu)特性已經(jīng)可以反映骨骼抵抗外力的能力 ,所以在本實(shí)驗(yàn)中,我們只檢測骨的結(jié)構(gòu)特性指標(biāo)，運(yùn)用股骨三點(diǎn)彎曲試驗(yàn)分別測定了彈性載荷、最大載荷、斷裂載荷等指標(biāo)，研究顯示, 口服組及肌內(nèi)注射組大鼠股骨的彈性載荷、最大載荷、斷裂載荷均明顯低于正常組，肌內(nèi)注射組大鼠的彈性載荷、最大載荷、斷裂載荷等指標(biāo)與口服組相比無顯著差異。這表明由于激素的運(yùn)用使得骨表面骨吸收活動(dòng)的增強(qiáng)，造成松質(zhì)骨骨量減少，尤其是造成骨結(jié)構(gòu)破壞是導(dǎo)致GIOP大鼠松質(zhì)骨骨強(qiáng)度明顯下降。此外，在本次研究中發(fā)現(xiàn)血清PINP水平明顯降低、β-CTX的含量升高，且都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這與部分學(xué)者報(bào)道有所差異，這可能是由于早期激素的使用導(dǎo)致了一個(gè)高轉(zhuǎn)換的骨代謝狀態(tài)，成骨和破骨的穩(wěn)態(tài)失衡所致。由此可見，肌內(nèi)注射潑尼松可能會更快破壞骨穩(wěn)態(tài)和骨細(xì)微結(jié)構(gòu)，更快導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的產(chǎn)生，本次實(shí)驗(yàn)的病理組織切片觀察也顯示口服組與肌內(nèi)注射組大鼠的骨小梁纖細(xì)疏松，造血組織減少，脂肪組織增多，且肌內(nèi)注射組表現(xiàn)更明顯，從而進(jìn)一步印證了這一論點(diǎn)。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明激素的運(yùn)用會影響大鼠骨密度、骨生物力學(xué)及骨代謝的變化，且不同的激素給藥方式所造成的影響存在一定的差異性。肌內(nèi)注射潑尼松會更快的減低骨密度、降低骨強(qiáng)度，破壞骨細(xì)微結(jié)構(gòu)，從而更早期的誘發(fā)骨質(zhì)疏松，由此可為臨床上一些不得不長期或短期使用激素的患者在用藥方式的選擇上提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，以期更好的達(dá)到預(yù)防骨質(zhì)疏松并發(fā)癥的目的。

(本文圖1見彩插14)。

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