隋小龍，梁良，張玲，朱華，徐艷峰，黃瀾，徐玉環(huán)，韓云林，姚志剛，秦川，鄧巍

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家中醫(yī)藥管理局人類疾病動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是老年人中最常見的癡呆類型，臨床上以進(jìn)行性認(rèn)知功能損害和嚴(yán)重的神經(jīng)功能下降為特點(diǎn)[1]。關(guān)于這種疾病的發(fā)病假說有很多種，其中較為接受的是Aβ級(jí)聯(lián)假說，該假說認(rèn)為淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)代謝產(chǎn)生的Aβ是AD的觸發(fā)因素。APP是一種I型跨膜蛋白，氨基端在胞外，羧基端在胞內(nèi)。APP有兩種代謝途徑，一個(gè)是淀粉樣蛋白(Aβ)生成途徑，另一個(gè)是抗Aβ生成途徑。在抗Aβ生成途徑中，APP被α分泌酶分解為sAPPα(soluble APPα)和α-CTF(α-carboxyl terminal fragment, C83)，α-CTF進(jìn)一步被γ分泌酶分解為p3和AICD(APP intracellular domain)；在Aβ生成途徑中，APP先被β分泌酶(β-site APP cleaving enzyme 1, BACE1)分解為sAPPβ(soluble APPβ)和β-CTF(β-carboxyl terminal fragment, C99)，β-CTF進(jìn)一步被γ分泌酶分解為Aβ和AICD[2]。α分泌酶現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)主要有ADAM10、 ADAM17和 ADAM9[3]，其中ADAM10是在腦內(nèi)起主要作用[4]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，PN-1顯著提高模型鼠在新物體識(shí)別和Morris水迷宮中的表現(xiàn)；能夠減少模型鼠腦內(nèi)老年斑(senile plaque, SP)沉積并能夠降低腦內(nèi)Aβ水平[5]，改善模型小鼠的社會(huì)交互行為，提高其耐力和平衡學(xué)習(xí)能力，并減輕其焦慮、煩躁、易激怒等精神狀況[6]。本文將進(jìn)一步探索PN-1在影響Aβ生成過程中的作用機(jī)制，以期為PN-1的進(jìn)一步臨床推廣應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

Western blot所用的儀器為凱元Mini P-4小型垂直電泳槽及Mini TBC濕式轉(zhuǎn)印槽，轉(zhuǎn)印的PVDF膜(0.22 μm/0.45 μm)購自Millipore(ISEQ00010/IPVH00010)；檢測抗體為：抗人sAPPβ野生型兔IgG (1∶50，IBL，18957); APP-C端單克隆抗體(1∶500，Convance, SIG-39152); Aβ1-16 (6E10)單克隆抗體(1∶1000，Covance, IG-39320); Aβ4G8單克隆抗體(1∶1000，covance，SIG-392007); 抗ADAM10抗體(1∶1000，Abcam，ab1997); 抗BACE1抗體(1∶1000，Abcam, ab2077); DAPI包埋劑(ZSGB，ZLI-9557)；HRP標(biāo)記β-actin抗體和HRP標(biāo)記GAPDH抗體(1∶10000，康成生物，KC-5A08，KC5G5)；FITC標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(ZSGB, ZF-0312); RIPA裂解液(強(qiáng))(碧云天生物，P0013B)；超敏二步法免疫組化檢測試劑盒(ZSGB，pv-9001)。

1.2 中藥

中藥I號(hào)方由20余味中藥組成，主要成分為黃芪、黨參、白術(shù)和肉蓯蓉，按照干重8∶2∶3∶2炮制。其粉劑用蒸餾水煮沸3次，每次30 min。將上清液合并調(diào)整至生藥濃度為1 g/mL，使用時(shí)稀釋至0.1 g/mL。本實(shí)驗(yàn)中的給藥濃度均折合成生藥質(zhì)量進(jìn)行計(jì)算。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)中所用到的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因模型小鼠由本所自己構(gòu)建，模型以C57BL/6J小鼠為背景，為含有人APP瑞典(Swedish)突變(K595N/M596L)和人PS1敲除了第九個(gè)外顯子的雙轉(zhuǎn)基因小鼠[7]。實(shí)驗(yàn)在中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物所進(jìn)行 [SYSK(京)2011-0022]。

1.4 分組及給藥

5月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠80只，根據(jù)體重隨機(jī)分為模型組、PN-1低劑量組(0.6 g/kg)，PN-1中劑量組(1.2 g/kg)和PN-1高劑量組(2.4 g/kg)，并以同窩陰性的C57BL/6J小鼠為正常對(duì)照組，每組16只，雌雄各半。給藥組小鼠每天灌胃給藥1次，同時(shí)模型組及正常組小鼠均給予等體積雙蒸水灌胃，給藥持續(xù)4個(gè)月。

1.5 Western Blot檢測APP代謝相關(guān)分子

將給藥結(jié)束后的小鼠頸椎脫臼處死，將左半腦存于-80℃，另一半加入1 mLRIPA裂解液(碧云天公司)提取蛋白，BCA法(Pierce公司, Pierce BCA Kit試劑盒)測定蛋白濃度。每組取6只動(dòng)物，每個(gè)樣本取70 μg后用4×加樣緩沖液loading buffer 和生理鹽水補(bǔ)齊至20 μL，100℃變性5min后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，然后用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，用對(duì)應(yīng)的一抗雜交4℃過夜。次日TBST洗后，用對(duì)應(yīng)的二抗室溫雜交1 h，TBS洗后ECL曝光、顯影和定影。然后用 Image J 分析灰度，此灰度值代表蛋白相對(duì)量。

1.6 免疫組化及免疫熒光

1.6.1 免疫組化

①常規(guī)石蠟切片經(jīng)過脫蠟、水化和抗原修復(fù)后，PBS(pH=7.4)沖洗(5 min，3次)；②滅活內(nèi)源性過氧化氫，10 min后PBS沖洗(5 min, 3次)；③加入羊血清工作液封閉30 min；④滴加一抗(應(yīng)用抗體稀釋液稀釋)，4℃過夜；⑤PBS沖洗(5 min，3次)后，加入一抗種屬對(duì)應(yīng)的免疫組化試劑盒中的試劑1，孵育15 min后，PBS沖洗(5 min，3次)，滴加試劑2，孵育15 min后，PBS沖洗(5 min，3次)；⑥D(zhuǎn)AB顯色，顯微鏡控制，調(diào)整各組抗體顯色時(shí)間最佳而且一致，PSB沖洗10 min，蒸餾水沖洗10 min；⑦蘇木素復(fù)染，沖洗，脫水，透明，中性樹膠封固，鏡檢。顯微鏡觀察，陽性產(chǎn)物呈棕褐色，陰性對(duì)照組無變化。陰性對(duì)照組用PBS代替一抗，其與步驟同上。

1.6.2 免疫熒光

免疫熒光同免疫組化的方法大致相同，①同上；②加入羊血清工作液封閉30 min；③滴加一抗(應(yīng)用抗體稀釋液稀釋)，4℃過夜；④PBS沖洗(5 min，3次)后，加入綠色熒光標(biāo)記的二抗(1∶200，PBS稀釋)，室溫孵育30 min；⑤PBS沖洗(5 min，3次)后，用含DAPI的水溶性封片劑封固后，鏡下觀察。

免疫組化及熒光的結(jié)果均采用Image-Pro Plus(5.1.0.20)分析其累計(jì)光密度、面積和計(jì)數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 中藥Ⅰ號(hào)方對(duì)APP的影響

正常對(duì)照組(WT)為非轉(zhuǎn)基因小鼠，無明顯條帶，模型組(vehicle)與低、中、高(0.6、1.2、2.4)給藥組的APP沒有明顯差異(圖1)。

注：一抗為6E10。#表示給藥組與模型組相比，P>0.05。

2.2 中藥Ⅰ號(hào)方對(duì)sAPPα的影響

相比于模型組，正常對(duì)照組檢測不到sAPPα；給予中藥后低、中、高劑量組sAPPα與模型組相比均明顯降低(圖1)。

2.3 中藥Ⅰ號(hào)方對(duì)sAPPβ的影響

模型組與正常對(duì)照組相比，sAPPβ明顯升高；而給予中藥后低、中、高劑量組sAPPβ與模型組相比均明顯降低，低、中、高劑量組間差異無顯著性(圖2)。

注：**表示給藥組與模型組相比P<0.01。

2.4 中藥Ⅰ號(hào)方對(duì)α-CTF和β-CTF的影響

正常對(duì)照組組中Western blot 不能檢測出α-CTF和β-CTF；模型對(duì)照組與正常對(duì)照組相比，α-CTF和β-CTF明顯升高；與模型組相比，給予中藥后低、中、高劑量組α-CTF和β-CTF均明顯降低，其中α-CTF降低到Western blot敏感性之下，低、中、高劑量組間α-CTF和β-CTF無差異(圖3)。

注：*表示給藥組和模型組相比，P<0.05; **表示與模型組相比，P<0.01。

2.5 中藥Ⅰ號(hào)方對(duì)ADAM10的影響

Western blot結(jié)果中，模型組與正常對(duì)照組相比，ADAM10明顯升高；而給予中藥后，低、中、高劑量組ADAM10與模型組相比均明顯降低，低、中、高劑量組間差異無顯著性(圖4)。

免疫組化結(jié)果中，ADAM10在全腦都有表達(dá)，給予中藥后，低、中、高劑量組與模型組相比，ADAM10陽性細(xì)胞數(shù)量和光密度均明顯降低，低、中、高劑量組間差異無顯著性(圖5，彩插4)。

2.6 中藥Ⅰ號(hào)方對(duì)BACE1的影響

模型組與正常對(duì)照組相比，BACE1明顯升高；而給予中藥后低、中、高劑量組BACE1與模型組相比均明顯降低，低、中、高劑量組間差異無顯著性(圖6)。

注：**表示給藥組與模型組相比，P<0.01。

免疫組化結(jié)果中，腦內(nèi)BACE1陽性的細(xì)胞為少數(shù)，但幾乎遍布全腦，給予中藥后，低、中、高劑量組與模型組相比，BACE1陽性細(xì)胞數(shù)量和光密度均明顯降低，低、中、高劑量組間差異無顯著性(圖7，彩插4)。

2.7 中藥Ⅰ號(hào)方對(duì)小鼠腦中老年斑的影響

與模型組相比，給藥組(低、中、高劑量)動(dòng)物腦內(nèi)老年斑從數(shù)量和面積相比均減少，低、中、高劑量組間差異無顯著性(圖8，彩插5)。

3 討論

AD是全世界老年人癡呆的首要原因，它以Aβ聚集形成SP和tau蛋白的高度磷酸化為特點(diǎn)[7]。AD的發(fā)病機(jī)制還尚未明確，關(guān)于AD的發(fā)病假說有很多種，其中Aβ級(jí)聯(lián)假說較為人接受，該假說認(rèn)為SP中的Aβ是引起AD病理過程中神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles, NFT)、細(xì)胞丟失、血管病變的直接原因[8]。Aβ在體內(nèi)沉積的原因很多，包括其生成增多、分解減少以及在腦實(shí)質(zhì)、腦脊液和血漿之間的轉(zhuǎn)移障礙[9]。目前對(duì)AD治療的學(xué)術(shù)研究有針對(duì)乙酰膽堿酯酶(乙酰膽堿酯酶抑制劑，如美金剛)，Aβ(阻止或逆轉(zhuǎn)hAPP/Aβ依賴的損害，如減少tau蛋白，cyclophilin D和Fyn；逆轉(zhuǎn) EphB2或Nav1.1的損害；將apoE4換為apoE3)和 tau蛋白等多種方法[10]，但還沒有延緩或停止AD腦細(xì)胞惡化的藥物。美國FDA批準(zhǔn)了5種只能暫時(shí)延緩癥狀惡化的藥物，而且只有少數(shù)的服藥者能收到預(yù)期的效果[11]。抑制Aβ的生成被認(rèn)為是AD的潛在治療策略[12]。目前針對(duì)降低腦內(nèi)Aβ負(fù)荷的策略有：1阻止Aβ的產(chǎn)生[13]；2增加Aβ的降解[14]；3免疫清除Aβ[15]。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)PN-1能顯著提高模型小鼠的記憶能力，能減少腦內(nèi)的SP和Aβ，本文在此基礎(chǔ)上完善了Aβ降低的機(jī)制。根據(jù)Aβ級(jí)聯(lián)假說，Aβ是引起AD一系列病理過程的直接初始因素。本研究發(fā)現(xiàn)APP在模型組和給藥組中沒有明顯差異，Aβ生成途徑關(guān)鍵酶BACE1減少，Western blot和免疫組化結(jié)果一致，但各給藥組間統(tǒng)計(jì)學(xué)變化不顯著。BACE1在給藥后受到抑制，導(dǎo)致APP分解產(chǎn)物β-CTF，sAPPβ的減少，SP也減少，前期結(jié)果中給藥組比模型組的Aβ的減少[5]也證明了這一點(diǎn)，這就很好的解釋了Aβ和SP減少的機(jī)制。與此同時(shí)，抗Aβ生成途徑在給藥后也受到了抑制，ADAM10，α-CTF和sAPPα在給藥組中明顯低于模型組，其中Western blot為整腦的組織勻漿，結(jié)果中低劑量組的ADAM10降低最明顯，而免疫組化我們?nèi)DAM10變化最明顯的海馬作為參照，中、高劑量組中ADAM10降低的程度略大于低劑量組，但兩組數(shù)據(jù)中低、中、高劑量組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。PN-1的治療使得APP分解的兩條途徑都受到了抑制(激活抗Aβ生成途徑能增加APP通過α分泌酶途徑的分解，減少其通過β分泌酶的量，從而減少Aβ的生成[16])，但減少的α分泌酶途徑并沒有影響APP通過β分泌酶分解減少(β-CTF、sAPPβ、Aβ及SP數(shù)量的降低)的總趨勢(shì)，即PN-1在治療PAP小鼠模型中有效。

中醫(yī)藥作為中華民族的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)維系了民族的繁衍與健康，為AD的治療提供了希望。中醫(yī)藥成分復(fù)雜，關(guān)于中藥單體的治療探索也有很多，效果也是顯著的[17]。復(fù)方中醫(yī)藥可能是多靶位治療，中藥Ⅰ號(hào)方由20余味中藥組成，為AD的多靶位治療提供了可能，可能比單一靶位治療效果更好。如果能在PN-1成分基礎(chǔ)上改動(dòng)，或添加一些西藥成分，增加α分泌酶的表達(dá)或活性，增加APP通過抗Aβ生成途徑的分解[18]，這樣就能更大程度上減少Aβ的生成和老年斑的沉積，從而收到更好的效果。

綜上所述，PN-1能夠同時(shí)抑制APP的α和β降解途徑，顯著降低Aβ的產(chǎn)生，為PN-1臨床推廣應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

(本文圖5,7見彩插4,圖8見彩插5。)

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