杜麗東，吳國(guó)泰，劉峰林，景琪，劉五州，任遠(yuǎn)

(1.甘肅中醫(yī)學(xué)院，蘭州 730000；2.甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730000)

腸易激綜合征(IBS)是現(xiàn)代社會(huì)環(huán)境下消化系統(tǒng)的多發(fā)病和常見(jiàn)疾病，表現(xiàn)為腹部不適或腹痛，胃腸動(dòng)力異常，大便性狀改變以及神經(jīng)精神改變?yōu)樘卣鞯陌Y候群，因其缺乏形態(tài)學(xué)、生化等特異改變，病因多樣且發(fā)病機(jī)制尚不明確[1]。研究表明[2,3]，IBS病人中存在5-羥色胺(5-HT)、P物質(zhì)(SP)、血管活性腸肽(VIP)等胃腸激素水平異常；多數(shù)患者伴有抑郁、焦慮、緊張等情緒變化。目前IBS動(dòng)物模型均不能完全反應(yīng)IBS復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制和病理生理學(xué)特征[4,5]。本研究采用復(fù)合因素誘導(dǎo)大鼠建立IBS模型，為有效開(kāi)展治療IBS的實(shí)驗(yàn)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠30只，雌雄各半，體重160～180 g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供【SCXK(甘)2011-0001】，在本中心無(wú)特定病原體(specific-pathogen free, SPF)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)【SYXK(甘)2011-0001】；SPF級(jí)飼料由北京科奧協(xié)力飼料有限公司供給，室溫(20±2)℃，相對(duì)濕度30%～40%，12 h明/12 h暗交替，適應(yīng)7 d后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 藥品與試劑

1.1.3 儀器

冰柜(北京福意電器有限公司，中國(guó))；烘箱(上海島韓實(shí)業(yè)有限公司，中國(guó))；振蕩器(哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠，中國(guó))；噪聲測(cè)定儀(北京天安聯(lián)合科技有限公司，中國(guó))；電子天平(德國(guó)賽多利斯，德國(guó))；GC-911-C-放射免疫計(jì)數(shù)器(中國(guó)科技大學(xué)實(shí)業(yè)總公司，中國(guó))；自制敞箱(80 cm×80 cm×40 cm)；全自動(dòng)生化分析儀(Alcyon300，美國(guó))；組織包埋機(jī)(TEK TEC5，日本櫻花)；全自動(dòng)密閉式組織脫水機(jī)(Tek VIP 5，日本櫻花)；石蠟切片機(jī)(Leica 公司，德國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 造模、分組與給藥

SD大鼠隨機(jī)分為正常組(10只)和模型組(20只)。正常組大鼠分性別每籠5只常規(guī)飼養(yǎng)，不給任何刺激。模型組大鼠每籠1只孤養(yǎng)，并加以不可預(yù)見(jiàn)性刺激，刺激因子包括禁水禁食、晝夜顛倒、冷刺激、熱刺激、致痛、制動(dòng)、高速震蕩和噪聲共8種，刺激因子在40 d內(nèi)隨機(jī)安排，每天1種，每種刺激出現(xiàn)5次，每種刺激不連續(xù)出現(xiàn)，造模40 d。刺激操作方法：①禁水禁食：24h內(nèi)斷水?dāng)嗉Z；②晝夜顛倒：于7:00時(shí)將動(dòng)物放入暗室中，不開(kāi)燈使動(dòng)物處于黑暗狀態(tài)；至19:00時(shí)將暗室中照明燈打開(kāi)，使動(dòng)物處于光照狀態(tài)，直至次日早7時(shí)取出；③冷刺激：將大鼠置于4℃冰柜中15 min后取出；④熱刺激：將大鼠置于45℃的烘箱中15 min后取出；⑤致痛：用止血鉗夾住大鼠距尾尖1 cm處(用力不宜過(guò)大，動(dòng)物發(fā)出哀叫聲即可)持續(xù)2 min；⑥制動(dòng)：將大鼠置于固定器中5 h；⑦高速震蕩：將大鼠放入振蕩器中，高速水平震蕩(110 r/min)15 min后取出；⑧噪聲：將大鼠置于玻璃鐘罩內(nèi)，給150 dB鬧鈴刺激10 min。

將模型動(dòng)物隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性組(匹維溴銨15.0 mg/kg體重，相當(dāng)于臨床成人日用量的7倍)，每組10只，按性別每籠5只常規(guī)飼養(yǎng)，于造模完成第2 天起按10 mL/kg體重容量灌胃給藥，正常組與模型組大鼠灌胃等容量蒸餾水，每天1次，連續(xù)31 d。

1.2.2 檢測(cè)指標(biāo)與方法

三是交通運(yùn)輸主管部門(mén)應(yīng)搭建統(tǒng)一的信息平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)航道主管部門(mén)建設(shè)的電子航道圖與海事AIS數(shù)據(jù)，以及船閘運(yùn)行單位、過(guò)閘船舶之間的信息互通共享。

(1)體重、攝食量： 在造模前、造模后和給藥第9、19、29天上午9:00時(shí)加飼料100 g，次日9:00時(shí)稱剩余飼料重，并稱體重，計(jì)算24 h攝食量，攝食量=(食物總量-食物余量)/體重。

(2)排便情況：在造模前、造模后和給藥第10、20、30天，在直徑 60 cm 的圓盆中盛滿水(水溫10±1℃)，水中央放置直徑10 cm的柱形平臺(tái)，平臺(tái)面高出水面約1 cm，將各組大鼠置于平臺(tái)上，觀察各大鼠2 h 內(nèi)排便情況，定形糞便記錄粒數(shù)，不定形或稀便記錄排便次數(shù)；并對(duì)每?；蛎看渭S便性狀評(píng)分，泄瀉稀便計(jì)0分，軟便無(wú)定形計(jì)1分，軟便定形計(jì)2分，固體定形計(jì)3分，累積記錄各大鼠2 h內(nèi)糞便的評(píng)分。

(3)自主運(yùn)動(dòng)量[6]：自制敞箱(高40 cm，長(zhǎng)寬均為80 cm，周壁為黑色，白色地面用黑線劃分為面積相等的25塊)，在暗的、無(wú)噪音、安靜的房間進(jìn)行。敞箱中央上方1 m處懸掛1個(gè)100 W燈泡。造模前、造模后和給藥第10、20、30天將每只大鼠置于敞箱中央，以5 min內(nèi)大鼠穿越地面方塊數(shù)作為水平運(yùn)動(dòng)得分，以5 min內(nèi)直立次數(shù)為垂直運(yùn)動(dòng)得分，將得分加和表示大鼠的運(yùn)動(dòng)量，每只大鼠測(cè)定一次。

(4)胃腸動(dòng)力[7]： 第31天給藥1 h后(事先已禁食不禁水12 h)，各組大鼠灌胃半固體糊每只2.0 mL(配制方法：16 g奶粉、8 g糖、5 g活性炭、10 g小鼠飼料粉(過(guò)80目篩)加入250 mL的5%的羧甲基纖維素懸液中，充分?jǐn)嚢杌靹?，30 min后股動(dòng)脈放血，取血約1 mL加入抗凝管制備血漿，另取血約2 mL自然凝固4 h制備血清，頸椎脫臼處死大鼠，開(kāi)腹，結(jié)扎幽門(mén)和賁門(mén)，取胃，用濾紙擦干后稱全重，然后沿胃大彎剪開(kāi)胃體，洗去胃內(nèi)容物后擦干，稱凈重。迅速取出小腸，分離系膜，輕輕直鋪于水平白色臺(tái)面上，測(cè)量小腸全長(zhǎng)(幽門(mén)至回盲部距離)及推進(jìn)距離(幽門(mén)至半固體糊前沿的距離)。分別計(jì)算胃排空率和腸推進(jìn)率。

胃排空率(%)=(灌胃半固體糊重 - 胃內(nèi)殘留糊重)/灌胃半固體糊重 × 100%，其中胃內(nèi)殘留糊重=胃全重 - 胃凈重；腸推進(jìn)率(%)=推進(jìn)距離/小腸全長(zhǎng) ×100%

(5)血清或血漿、結(jié)腸勻漿5-HT、SP和VIP含量：大鼠動(dòng)脈血室溫靜置4 h，低溫離心3000 r/min×15 min，分離血清-20℃保存，抗凝血低溫離心4000 r/min×15 min，分離血漿-20℃保存，按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定血清5-HT、血漿SP和VIP含量；測(cè)完腸推進(jìn)后迅速摘取大鼠肛門(mén)上方3 cm處結(jié)腸1～2 cm，用生理鹽水洗凈內(nèi)容物，稱重后加入冷生理鹽水手動(dòng)研磨制備10%的組織勻漿，于4000 r/min×20 min離心，取上清-20℃保存，按試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定組織勻漿5-HT、SP和VIP含量。

(6)血液生化指標(biāo)檢測(cè)及組織形態(tài)學(xué)檢查：大鼠動(dòng)脈血室溫靜置4h，低溫離心3000 r/min×15 min，分離血清，用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、肌酐(Cr)、血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、尿素氮(BUN)、葡萄糖(GLU)的水平。

取大鼠胃竇組織和橫結(jié)腸組織各一塊，用4%的中性甲醛液固定，行H-E染色，光學(xué)顯微鏡下觀察胃竇組織和腸黏膜病理組織學(xué)改變。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 體重變化

與正常組比較，造模后大鼠體重明顯減輕(P<0.01)，給藥第10天，各組大鼠體重均有增加，但與模型組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；給藥第20天和第30天，陽(yáng)性組大鼠增加顯著(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 IBS模型大鼠的體重變化±s，n=10)

2.2 攝食量變化

與正常組比較，造模后各組大鼠24 h內(nèi)平均攝食量明顯減少(P<0.01)，給藥第10天，各組大鼠平均攝食量均有增加，但與模型組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；給藥第20天和30天，陽(yáng)性組大鼠增加顯著(P<0.05，P<0.01)。見(jiàn)圖1。

圖1 IBS模型大鼠24 h內(nèi)平均攝食量變化

2.3 排便情況

與正常組比較，造模后各組大鼠2 h內(nèi)排便量明顯增多(P<0.01)，給藥第10天和20天，陽(yáng)性組大鼠排便量減少(P<0.05)。造模后各組大鼠均出現(xiàn)稀便和無(wú)定形軟便(P<0.01)，給藥第10天，各組大鼠稀便減少，以無(wú)定形軟便為主，陽(yáng)性組組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；給藥第20天和30天，陽(yáng)性組大鼠固體粒狀糞便增多(P<0.05)。見(jiàn)表2，3。

表2 IBS模型大鼠排便量的變化±s，n=10)

表3 IBS模型大鼠糞便性狀總評(píng)分的變化±s，n=10)

2.4 自主運(yùn)動(dòng)量的變化

與正常組比較，造模后各大鼠均出現(xiàn)蜷縮、喜臥、萎靡等狀態(tài)，自主運(yùn)動(dòng)量減少(P<0.01)，給藥第10天和第20天，陽(yáng)性組大鼠運(yùn)動(dòng)量增加，但與模型組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；給藥第30天，陽(yáng)性組大鼠運(yùn)動(dòng)量接近正常(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 IBS模型大鼠自主運(yùn)動(dòng)量的變化±s，n=10)

2.5 胃腸動(dòng)力的變化

與正常組比較，模型組大鼠胃排空率明顯減小、腸推進(jìn)率明顯加快(P<0.01)，陽(yáng)性組大鼠胃排空率明顯增加、腸推進(jìn)率明顯減小(P<0.05)。見(jiàn)表5。

表5 IBS模型大鼠胃排空率和腸推進(jìn)率的變化±s，n=10)

2.6 血清5-HT、血漿SP和VIP含量的變化

與正常組比較，模型組大鼠血清5-HT含量明顯升高、血漿SP和VIP含量均明顯降低(P<0.01)，陽(yáng)性組大鼠血清5-HT含量明顯下降、血漿SP含量明顯升高(P<0.05),見(jiàn)表6。

表6 IBS模型大鼠血清5-HT、血漿SP和VIP含量的變化±s，n=10)

2.7 結(jié)腸勻漿5-HT、SP和VIP含量的變化

與正常組比較，模型組大鼠結(jié)腸勻漿5-HT和SP含量明顯升高(P<0.01)，但結(jié)腸勻漿VIP含量變化不明顯；陽(yáng)性組大鼠結(jié)腸勻漿5-HT、SP和VIP含量明顯下降(P<0.05，P<0.01),見(jiàn)表7。

表7 IBS模型大鼠結(jié)腸勻漿5-HT、SP和VIP含量的變化±s，n=10)

2.8 血清ALT、AST、Cr、TC、TG、TP、ALB、BUN和GLU含量的變化

與正常組比較，模型組和陽(yáng)性組大鼠血清ALT、AST、Cr、TC、TG、TP、ALB、BUN和GLU含量，組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,見(jiàn)表8。

表8 IBS模型大鼠血清生化檢驗(yàn)結(jié)果±s，n=10)

2.9 IBS模型大鼠胃竇、結(jié)腸病理學(xué)觀察

各組大鼠胃黏膜結(jié)構(gòu)完整，無(wú)充血、水腫、潰瘍、無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等組織學(xué)改變，胃竇平滑肌細(xì)胞及腺體細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞形狀規(guī)則，細(xì)胞間隙均勻；各組大鼠腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，無(wú)充血、水腫、潰瘍、無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等組織學(xué)改變。見(jiàn)圖2和圖3(彩插1)。

3 討論

目前IBS動(dòng)物模型主要是以中樞(社會(huì)心理因素)或外周(腸道炎癥、感染因素)為刺激靶點(diǎn)建立的IBS模型[8]，本研究根據(jù)IBS患者的發(fā)病特點(diǎn)和主要病因，遴選出8種致病因素作為模型復(fù)制的刺激因子，采用隨機(jī)排列，使動(dòng)物不可預(yù)見(jiàn)刺激作用，造模40d，基本出現(xiàn)了IBS臨床病人具備的大體癥狀，且未見(jiàn)動(dòng)物死亡，模型比較穩(wěn)定，更適合進(jìn)行藥效評(píng)價(jià)和基礎(chǔ)研究。

5-HT、VIP和SP是主要的胃腸激素，與IBS發(fā)生有直接關(guān)系，在調(diào)節(jié)內(nèi)臟感覺(jué)和運(yùn)動(dòng)起重要作用[9]。IBS患者外周組織5-HT含量增高是內(nèi)臟痛覺(jué)過(guò)敏的主要發(fā)病機(jī)制[10]；本研究發(fā)現(xiàn)，模型大鼠血清和結(jié)腸組織5-HT含量明顯增高，匹維溴銨治療30d后，陽(yáng)性組大鼠血清和結(jié)腸組織5-HT含量明顯下降，有利于提高內(nèi)臟痛閾，消除腸道過(guò)敏；本研究中，IBS模型大鼠結(jié)腸組織SP含量增加，血漿SP含量降低。結(jié)腸中SP含量的增加可能與模型動(dòng)物排便增加，胃腸運(yùn)動(dòng)亢進(jìn)有關(guān)，與前期研究結(jié)果一致[11]；匹維溴銨能明顯降低結(jié)腸組織SP含量，從而改善胃腸動(dòng)力，消除腸道過(guò)敏。VIP 是抑制胃腸運(yùn)動(dòng)的主要神經(jīng)遞質(zhì)之一，具有松弛胃腸平滑肌、促進(jìn)腸道水和電解質(zhì)的分泌的功能[12]。

綜上所述，IBS模型大鼠表現(xiàn)為腸道敏感性較高，腸推進(jìn)率較大，腹瀉明顯，腦腸軸5-HT和VIP過(guò)度分泌等病理生理特征，匹維溴銨具有促使其向正常水平恢復(fù)的作用。

(本文圖2,3見(jiàn)彩插1。)

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