王倩, 陳陽美,郭靖,楊小蘭，謝運(yùn)蘭

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，重慶 400010;

2.資陽市樂至縣人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，四川 資陽 641500；

3.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，重慶 400010)

癲癇(epilepsy)是一種由不同病因引起的以腦部神經(jīng)元高度同步異常放電所致的短暫性腦功能失常為特征的慢性腦部疾病[1]。癲癇反復(fù)發(fā)作可導(dǎo)致神經(jīng)元的壞死和凋亡、特異性突觸重塑、膠質(zhì)增生及苔蘚纖維出芽等，其中特異性突觸重塑及苔蘚纖維出芽可促進(jìn)異常興奮性環(huán)路的形成，進(jìn)而發(fā)展成為難治性癲癇[2-7]。大量癲癇病理生理研究研究表明，異常的軸突、樹突的生長發(fā)育形成了異常的突觸，這可能是導(dǎo)致異常的興奮性神經(jīng)環(huán)路形成的原因之一，從而促使了癲癇的發(fā)生與發(fā)展。樹突棘位于突觸后成分中，其形成和降解的動態(tài)變化被認(rèn)為是突觸可塑性的標(biāo)志[8,9]。Schratt等[10]研究結(jié)果顯示microRNA-134(miR-134)可調(diào)控樹突棘的形態(tài)。CREB是神經(jīng)元可塑性重要的調(diào)節(jié)因子，其磷酸化活性形式對樹突生長和樹突精細(xì)結(jié)構(gòu)的調(diào)節(jié)起重要作用[11-14]。而miR-134 通過轉(zhuǎn)錄后機(jī)制調(diào)節(jié)CREB蛋白的表達(dá)，miR-134過表達(dá)可抑制CREB的翻譯負(fù)性調(diào)節(jié)突觸可塑性；反之則增加突觸的可塑性[15]。本研究通過觀察難治性癲癇組與非難治性癲癇組顳葉組織、正常對照與癲癇模型大鼠海馬組織miR-134、CREB、pCREB的表達(dá)變化，探討miR-134/CREB/pCREB信號通路在癲癇發(fā)生發(fā)展過程中的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

42只清潔級成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠來自重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心【SCXK(渝)2012-0002】，體重(200±20) g，6～8周齡，飼養(yǎng)于環(huán)境溫度22～26℃，濕度50%～60%，12 h晝夜循環(huán)，自由進(jìn)食及飲水的標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中【SYXK(渝)2010-0002】，所有試驗(yàn)過程遵照重慶醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會的規(guī)定。將實(shí)驗(yàn)動物按隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組及癲癇點(diǎn)燃后1、3、7、14、30、60 d組，每組6只。

1.2 氯化鋰—匹羅卡品癲癇模型

癲癇組大鼠腹腔注射氯化鋰127 mg/kg，16～20 h后注射匹羅卡品35 mg/kg(Sigma公司)，在注射匹羅卡品30 min前注射阿托品1 mg/kg，發(fā)作嚴(yán)重程度按照Racine分級[16]方法(0級：無任何反應(yīng)；Ⅰ級：面部陣攣，包括眨眼、動須、節(jié)奏性咀嚼等； Ⅱ級：Ⅰ級加節(jié)律性點(diǎn)頭：Ⅲ級：Ⅱ級加前肢陣攣；Ⅳ級：Ⅲ級加后肢站立；Ⅴ級：Ⅳ級加摔倒)，實(shí)驗(yàn)動物連續(xù)3次達(dá)到IV-V級發(fā)作即被認(rèn)為達(dá)到癲癇持續(xù)狀態(tài)(status epilepticus, SE), SE點(diǎn)燃后45 min腹腔給予地西泮10 mg/kg終止發(fā)作，未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)的大鼠反復(fù)給予匹羅卡品10 mg/kg，每15 min一次，直至出現(xiàn)SE為止，每只大鼠總量不超過50 mg/kg。對照組大鼠腹腔注射生理鹽水代替匹羅卡品，其余處理同癲癇組。

1.3 人顳葉組織標(biāo)本

(1)實(shí)驗(yàn)中所涉及的14例難治性癲癇患者顳葉病灶標(biāo)本來自第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院。進(jìn)行外科手術(shù)的顳葉癲癇患者其臨床表現(xiàn)均達(dá)到難治性癲癇的診斷標(biāo)準(zhǔn)：正規(guī)使用3種及以上的AES藥物，血藥濃度處于維持水平，使用2年仍不能控制癲癇發(fā)作；每月癇性發(fā)作4次以上；排除其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。病灶病理改變主要為：神經(jīng)元缺失、變性、膠質(zhì)細(xì)胞增生，取材部位為顳葉皮質(zhì)；患者平均年齡：(20.38±10.22)歲。

(2)10例非癲癇對照組標(biāo)本來源于第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院神經(jīng)外科，患者為顱腦損傷，顱內(nèi)高壓，需外科開顱減壓者。納入標(biāo)準(zhǔn)為：診斷腦外傷明確，其他非癲癇顱腦疾病引起的顱內(nèi)高壓，需手術(shù)治療，術(shù)后病理檢查腦組織結(jié)構(gòu)正常；無癲癇病史和家族史；取材部位為顳葉皮質(zhì)?；颊咂骄挲g：(36.80±13.01)歲。

1.4 試劑

匹魯卡品(Sigma公司,美國)，RNA提取、SYBR Premix Ex TaqTMII、RNAiso Plus、PrimeScript RT reagent Ki試劑盒(TaKaRa公司，中國大連)，U6 及 miR-134 特異性反轉(zhuǎn)錄及 PCR 引物(南京金斯瑞，中國南京)，全蛋白提取試劑盒(凱基公司，中國南京)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強(qiáng)型)(碧云天公司，中國上海)，CREB、pCREB多克隆一抗(Cell Signaling Technology，美國)，NPY(武漢三鷹公司，武漢)。

1.5 組織處理

(1)將術(shù)中獲得的人腦顳葉皮質(zhì)標(biāo)本分成兩部分：一份保存于液氮中作為RT-PCR及Western blot的實(shí)驗(yàn)材料；一份放入4%多聚甲醛中保存24h后石蠟包埋組織，并將組織切成5μm厚度，作為免疫組化實(shí)驗(yàn)材料。

(2)造模成功后每組3只大鼠腹腔注射3.5%水合氯醛1mL/kg后斷頭取腦，分離出兩側(cè)海馬,立即浸入液氮中分別用于RT-PCR及Western blot檢測。其余大鼠用4%多聚甲醛灌注固定后分離大腦，用石蠟包埋后冠狀位切片，厚5 μm，用于免疫組織化學(xué)分析。

1.6 實(shí)時熒光定量PCR檢測

取液氮保存的人顳葉皮質(zhì)標(biāo)本及大鼠海馬組織提取總 mRNA。采用 RNAiso plus試劑(TaKaRa 公司)，按操作說明書提取。提取的總 RNA樣本在加入RNase-free水完全溶解 RNA沉淀后-80 ℃中保存。RNA的濃度和純度用 260 / 280 nm下檢測，260 / 280 nm在1.9～ 2.20之間。反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)采用 TaKaR的反轉(zhuǎn)錄試劑盒，步驟為① 37 ℃ 60 min；② 85℃ 5 s。反應(yīng)在 96孔 PCR板中進(jìn)行，每個反應(yīng)做3個復(fù)孔。PCR反應(yīng)體系為 20 μL，RT 1μL，上下游引物各0.5 μL，SYRB Green熒光染料(TaKaRa 公司)10 μL，去離子水8 μL。反應(yīng)條件為① 95 ℃，30 s； ② 95 ℃，5 s,60℃，20 s，40個循環(huán)。miR-134和β-actin的標(biāo)準(zhǔn)曲線保證擴(kuò)增的效率在90%～110%之間。擴(kuò)增和溶解曲線及數(shù)據(jù)用Bio-Rad CFX Manager軟件分析。實(shí)時定量PCR雙向引物序列：miR-134：5′-GGGGTGTGACTGGTTGAC-3′(南京金斯瑞，中國)，U6：F：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′：R：5′-CGCTICACGAATITGCGTGTCAT-3′。結(jié)果用平均2-ΔΔCT法進(jìn)行分析。

1.7 Western blot檢測

人顳葉皮質(zhì)組織、海馬組織提取全蛋白，根據(jù)全蛋白提取試劑盒說明提取，BCA法檢測蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白：轉(zhuǎn)膜采用全濕法，按照 3 張濾紙、PVDF 膜、完成電泳的膠、3 張濾紙的順序依次排放，250 mA電流電轉(zhuǎn)1 h；5%脫脂奶粉37℃封閉1 h；分別加入PBS稀釋過的marker蛋白(β-actin，1∶1000)、兔多克隆CREB一抗(1∶100)及兔多克隆pCREB一抗(1∶50)，4℃冰箱過夜；TBST搖洗10 min×4次；加入TBST稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶4000)，與膜37℃孵育1 h；再次TBST搖洗10 min×4次；ECL顯色。應(yīng)用Quantity One 圖像分析軟件，計(jì)算 PVDF 膜上條帶的光密度值。用目的條帶的光密度值比相應(yīng)內(nèi)參 β-actin 條帶的光密度值得到該蛋白在組織中的表達(dá)量。

1.8 免疫組織化學(xué)檢測

將組織切片在二甲苯中脫蠟，梯度酒精中脫水。自來水沖洗5 min，PBS磷酸鹽緩沖液中浸泡3 min后于3%H2O237℃反應(yīng)10 min，以滅活內(nèi)源性過氧化物酶，PBS緩沖液沖洗3 min×3次，用枸櫞酸抗原修復(fù)，煮沸3 min，92～98℃15 min，室溫自然冷卻后PBS緩沖液沖洗5 min×3次，滴加正常山羊封閉血清，37℃ 30 min；甩去多余血清加入稀釋后的兔多克隆CREB一抗(1∶400)，兔多克隆pCREB一抗(1∶100)，陰性對照組用PBS代替一抗，4℃冰箱中過夜，第二日37℃孵育60 min復(fù)溫，PBS緩沖液沖洗5min×3次，滴加生物素標(biāo)記羊抗兔二抗工作液(中杉金橋)，37℃ 30 min，PBS沖洗5 min×3次，辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液(中杉金橋)37℃30 min，PBS沖洗5 min×3次，DAB顯色，經(jīng)蘇木素復(fù)染，酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。采用奧林巴斯BX51自動圖片采集系統(tǒng)采集圖片。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時熒光定量PCR測定miR-134

在大鼠癲癇點(diǎn)燃后72h(0.026±0.014)、7 d(0.021±0.007)、14 d(0.008±0.005)、60 d(0.015±0.004)miR-134的表達(dá)水平相對于正常對照組(0.034±0.017)表達(dá)明顯降低(P<0.05)，14 d達(dá)到最低，而在1 d(0.031±0.018)、30d(0.030±0.012)時間點(diǎn)無明顯差異(P>0.05)；在難治性癲癇患者顳葉皮質(zhì)中miR-134的表達(dá)(0.062±0.039)較對照組(0.137±0.086)明顯降低(P<0.05)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1。

注：癲癇模型組(a),臨床標(biāo)本(b)比較， P<0.05。

2.2 Western blot檢測結(jié)果

2.2.1 CREB在人顳葉皮質(zhì)及癲癇大鼠腦組織中的表達(dá)

CREB在人顳葉皮質(zhì)及大鼠海馬中均有表達(dá)，在癲癇大鼠點(diǎn)燃成功后1 d(0.214±0.088)及30 d(0.273±0.117)表達(dá)較對照組(0.225±0.04)無明顯變化(P>0.05)，在3 d(0.423±0.123)、7 d(0.416±0.079)、14 d(0.44±0.054)、60 d(0.382±0.052)較對照組明顯增加(P<0.05)；人顳葉皮質(zhì)中難治性癲癇組CREB表達(dá)(0.335±0.177)較非難治性癲癇對照組表達(dá)(0.180±0.068)增加(P<0.05)，差異具有顯著性。見圖2。

注：癲癇模型(a；b)臨床樣本(c；d)比較， P<0.05。

2.2.2 pCREB在人顳葉皮質(zhì)及癲癇大鼠腦組織中的表達(dá)

pCREB在人顳葉皮質(zhì)及大鼠海馬中均有表達(dá)，在癲癇大鼠點(diǎn)燃成功后1 d(0.386±0.055)、3 d(0.425±0.082)、7 d(0.379±0.074)、14 d(0.517±0.126)、30 d(0.492±0.037)、60 d(0.441±0.075)表達(dá)較對照組(0.174±0.045)均明顯增加(P<0.05)；人顳葉皮質(zhì)中難治性癲癇組pCREB表達(dá)(0.43±0.18)較非難治性癲癇對照組表達(dá)(0.27±0.115)增加(P<0.05)，差異有顯著性。見圖3。

注：癲癇模型(a；b)臨床樣本(c；d)比較， P<0.05。

2.3 免疫組化結(jié)果

2.3.1 CREB在癲癇大鼠腦組織中的表達(dá)

癲癇大鼠腦組織的海馬區(qū)CREB陽性表達(dá)主要見于齒狀回、CA1及CA3區(qū)神經(jīng)元胞核。癲癇模型組72h時間點(diǎn)CREB表達(dá)明顯多于正常對照組見圖4(彩插3)。人顳葉皮質(zhì)中CREB陽性表達(dá)主要存在于神經(jīng)元細(xì)胞核中，且癲癇組明顯多于對照組見圖5(彩插3)。

2.3.2 pCREB在癲癇大鼠腦組織中的表達(dá)

癲癇大鼠腦組織的海馬區(qū)pCREB陽性細(xì)胞主要見于齒狀回、CA1及CA3區(qū)神經(jīng)元胞核。癲癇模型組72h時間點(diǎn)CREB表達(dá)明顯強(qiáng)于正常對照組見圖6(彩插2)。 人顳葉皮質(zhì)中pCREB陽性表達(dá)主要存在于神經(jīng)元細(xì)胞核中，且癲癇組明顯多于對照組見圖7(彩插2)。

3 討論

顳葉癲癇是一種常見的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其特征為復(fù)發(fā)性癲癇[1-3]。大量病理研究分析表明，苔蘚纖維出芽(mossy fiber sprouting, MFS)和特異性突觸重組是造成難治性癲癇的主要病理基礎(chǔ)，其中MFS是突觸重組的主要形式，廣泛存在于難治性癲癇患者標(biāo)本和癲癇動物模型中[17,18]。氯化鋰-匹羅卡品大鼠是理想的顳葉癲癇模型，急性期表現(xiàn)為癲癇持續(xù)狀態(tài)，隨后有大約兩周的潛伏期是異常興奮性環(huán)路形成的關(guān)鍵時期并伴隨動物一生，慢性期主要表現(xiàn)為自發(fā)性反復(fù)發(fā)作[28]，這與人類難治性癲癇的發(fā)生發(fā)展機(jī)制較為相似。眾多研究顯示[19,20]，microRNA(miR) 是一類長20bp左右具有高度保守性的，內(nèi)源性非編碼小RNA，其作為廣泛存在與哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的基因表達(dá)調(diào)控因子，在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、神經(jīng)細(xì)胞分化、樹突生長和突觸重組中起重要作用。它主要通過核酸特異性序列的互補(bǔ)結(jié)合，在蛋白質(zhì)翻譯水平降解靶mRNA或抑制其表達(dá)，從而起到沉默基因、調(diào)控表達(dá)的作用。越來越多研究表明[7-9]，樹突棘作為突觸后成分，是突觸后興奮性傳導(dǎo)的重要部位，突觸重塑與腦中一些特殊表達(dá)的miR密切相關(guān)。

miR-134是腦內(nèi)一種特殊的小RNA，廣泛分布于海馬神經(jīng)元上，參與調(diào)控神經(jīng)元的微觀結(jié)構(gòu)，負(fù)性調(diào)節(jié)樹突棘的大小并通過調(diào)節(jié)樹突功能而參與癲癇的病理發(fā)生過程。miR-134過表達(dá)可減小樹突棘的體積[21-23]。對臨床標(biāo)本檢測中，miR-134在難治性癲癇組表達(dá)明顯低于非癲癇組；在動物實(shí)驗(yàn)中，miR-134 在癲癇大鼠模型成功點(diǎn)燃后 72h開始下降，直到 60d仍保持低水平，人及動物標(biāo)本中這種在癲癇慢性期長期保持低水平的狀態(tài)可能與癲癇慢性期重塑后的突觸穩(wěn)定性增加，及穩(wěn)定的異常神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成有關(guān)。 CREB存在于腦內(nèi)所有細(xì)胞細(xì)胞核中，是轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族的成員,參與了許多細(xì)胞內(nèi)信號通路的信號傳遞,有研究表明CREB可促進(jìn)記憶涉及新的突觸聯(lián)系生長或形成[24]。當(dāng)細(xì)胞膜受到刺激時可引起胞內(nèi)CREB的轉(zhuǎn)錄發(fā)生變化，而CREB則通過改變靶基因的表達(dá)，調(diào)節(jié)神經(jīng)元所有類型蛋白的表達(dá)，進(jìn)而影響單個神經(jīng)功能最終影響整個神經(jīng)回路。在發(fā)育成熟神經(jīng)元中，轉(zhuǎn)錄因子CREB在樹突生長[25]和活性調(diào)節(jié)樹突的精細(xì)結(jié)構(gòu)方面起重要作用[26]，其調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵步驟包括二聚體形成，結(jié)合到DNA反應(yīng)原件以及磷酸化。CREB蛋白的生物學(xué)活性受磷酸化的調(diào)控，磷酸化作用可以增強(qiáng)CREB的轉(zhuǎn)錄活性。miR-134 通過轉(zhuǎn)錄后機(jī)制調(diào)節(jié)CREB蛋白的表達(dá)，在正常狀態(tài)下，miR-134對CREB蛋白的表達(dá)起抑制作用，miR-134表達(dá)增加，對CREB的抑制加強(qiáng)[27]；反之，miR-134 表達(dá)降低對CREB蛋白的翻譯抑制作用解除導(dǎo)致CREB表達(dá)升高，并增加其磷酸化的功能活性形式(pCREB)含量，具有功能活性的pCREB可促進(jìn)下游miR-132表達(dá)上調(diào)進(jìn)而激活相關(guān)信號通路，導(dǎo)致細(xì)胞骨架肌動蛋白聚合，增加樹突棘的密度及體積最終調(diào)節(jié)突觸的可塑性，促使苔蘚纖維出芽形成異常神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，導(dǎo)致癲癇長期反復(fù)發(fā)作及耐藥。在癲癇臨床標(biāo)本及動物模型中CREB與pCREB表達(dá)較對照組均明顯且保持上升，CREB磷酸化生物活性增強(qiáng)表明CREB/pCREB可能參與了癲癇的病理發(fā)生發(fā)展過程。miR-134、CREB、pCREB在癲癇發(fā)生發(fā)展過程中的表達(dá)結(jié)果提示，miR-134/CREB/pCREB通路可能參與了癲癇慢性期突觸可塑性變化的調(diào)節(jié)。

我們通過檢測難治性顳葉癲癇患者及癲癇大鼠模型各時間點(diǎn)miR-134、CREB、pCREB的表達(dá)情況，在一定程度上推測miR-134/CREB/pCREB通路參與了人及大鼠癲癇的病理發(fā)生發(fā)展機(jī)制，為進(jìn)一步探討該通路下游信號通路對癲癇的影響提供了理論及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。然而，在不同種屬腦組織內(nèi)，CREB表達(dá)以及功能激活所受到的諸多調(diào)控因素可能有所不同，故以miR-134/CREB/pCREB為基礎(chǔ)探討癲癇的病理發(fā)生發(fā)展機(jī)制還需更全面的深入研究。

(彩插4,5見彩插2,彩插6,7見彩插3)。

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