秦波音，張小楠 ，楊華, 周文江,2，周曉輝

(上海市公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508；2.復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院動物中心，上海 201203)

肝癌(HCC)是全世界死亡率最高的惡性腫瘤之一，近20年來其病死率呈日益上升趨勢。我國是肝癌高發(fā)國家，據(jù)統(tǒng)計每年約有11萬人死于肝癌，約占全世界肝癌死亡人數(shù)的45%，發(fā)病率居我國惡性腫瘤發(fā)病率的第2位。肝癌發(fā)病隱匿，早期常無臨床癥狀，發(fā)現(xiàn)時多為晚期[1-2]。肝癌是由病毒和化學(xué)致癌物等多病因作用而引起的肝細胞生長失控導(dǎo)致癌變，經(jīng)啟動、促進和演變等多階段的發(fā)病過程，并與基因調(diào)控和表達密切相關(guān)[3]，但目前肝癌的致病機理尚未研究清楚。建立接近人類肝癌臨床特征的動物模型，對于深入闡明肝癌的致病機理和臨床藥物篩選具有非常重要的意義。小鼠肝癌模型是比較經(jīng)濟和實用的動物模型，而以往的研究通常是在多個固定時間點對肝癌小鼠的肝臟進行解剖和病理學(xué)觀察，這對于研究肝癌的疾病進程和藥物篩選具有很大的局限性[4]。

本研究利用小動物活體成像儀——Micro-CT，結(jié)合一種特殊的納米顆粒造影劑可以對小鼠的肝臟進行造影，實現(xiàn)對肝臟區(qū)域的連續(xù)無創(chuàng)性監(jiān)測，為利用小鼠開展肝癌致病機理相關(guān)研究以及腫瘤藥物的篩選提供有力的技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑

美國通用公司(GE General Electric Company)小動物活體Micro-CT系統(tǒng)，型號為eXplore Locus，最高分辨率為27 μm，后處理軟件為系統(tǒng)自帶的MicroView 2.0(GE Health Care Co.)。

納米顆粒造影劑為 Miltenyl Biotech公司生產(chǎn)的 Exitron nano 12000，是一種基于堿土金屬的納米級造影顆粒，其平均直徑為110 nm。

1.1.2 實驗動物及分組

6～8周齡SPF級雄性C57BL/6J小鼠6只和16月齡的HBV轉(zhuǎn)基因肝癌模型小鼠3只，來源于上海市公共衛(wèi)生臨床中心實驗動物部【SCXK(滬)2010-0024】。實驗在上海市公共衛(wèi)生臨床中心實驗動物部進行【SYXK(滬)2010-0098】。實驗小鼠隨機共分為3組：低劑量造影組(A組)3只、高劑量造影組(B組)3只和肝癌模型造影組(C組)3只。

1.2 實驗方法

1.2.1 造影劑注射及掃描時間

將3組實驗小鼠分別固定，酒精擦拭尾靜脈，A組注射50 μL納米顆粒造影劑，B組注射100 μL造影劑。在注射造影劑前(0 min)，注射后3 min、24 h、7 d、14 d、28 d和56 d對所有小鼠進行Micro-CT掃描。C組根據(jù)A組與B組的結(jié)果比較，選擇合適劑量進行造影和掃描。

1.2.2 Micro-CT掃描及重建

將實驗小鼠麻醉后(腹腔注射1%的戊巴比妥鈉，50 mg/kg)，仰臥平放于CT掃描床上，小鼠胸部用繃帶壓迫進行固定。選擇儀器自帶的“Scan”應(yīng)用軟件，以Fluro方式選擇胸腹部區(qū)域進行掃描，自定義掃描方案(Protocol)，具體掃描參數(shù)如下：掃描分辨率為93 μm，管電壓50 kV，管電流450 μA，掃描模式360°旋轉(zhuǎn)，掃描時間為16 min，平均幀數(shù)2幀，角度增益0.7°，曝光時間300 ms，探測器組件模式4×4。掃描同時將標(biāo)準(zhǔn)體模放于樣品床下方，用于CT值的校正，掃描完成后將生成的原始圖像經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)體模校正后重建至精度為93 μm的高分辨率圖像。

1.2.3 增強前后灰度值對比曲線測定

對A組和B組每個掃描時間點小鼠的肝臟進行分析，在小鼠肝臟左葉、肝右葉的中心區(qū)域和邊緣區(qū)域(避開大血管)分別通過高級ROI方式(advanced ROI)各選取2個圓柱體為感興趣區(qū) (region of interest，ROI)進行灰度值(gray scale value)均值測定，單個ROI的圓底直徑為2.5 mm，高為5個斷層掃描層面的間距，ROI體積為2.25 mm3，計算整個肝臟的平均灰度值。將未注射納米顆粒造影劑前肝臟的灰度值和注射造影劑后各時間點的灰度值比較并繪制成曲線，用于評價該造影劑的增強作用。

1.2.4 肝癌模型小鼠Micro-CT動態(tài)觀察

對C組小鼠分別在注射造影劑前(0 min)，注射后3 min、24 h、7 d、14 d、28 d和56 d對所有小鼠進行Micro-CT掃描，監(jiān)測C組小鼠肝臟腫瘤的影像學(xué)變化。

1.2.5 肝癌模型小鼠組織病理學(xué)檢查

對C組小鼠于第56天全部安樂死，取肝組織，中性緩沖福爾馬林固定后，做常規(guī)石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

所有實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，實驗結(jié)果應(yīng)用GraphPad Prism v 5.0軟件進行數(shù)據(jù)管理和分析，采用獨立樣本t檢驗進行組間比較，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

注：B組與A組相比差異有顯著性(**P<0.01)。

2 結(jié)果

2.1 兩種濃度造影劑在不同時間點的增強效果

A組和B組小鼠在注射造影劑前和注射后各時間點進行Micro-CT活體掃描，選取小鼠肝臟的CT灰度值制作“肝臟增強效果曲線”(圖1)。結(jié)果顯示：正常小鼠在注射兩種不同濃度的造影劑后，肝臟感興趣區(qū)的平均灰度值均比注射前明顯升高，在注射后24 h達到峰值，A組和B組注射后24 h小鼠肝臟感興趣區(qū)的平均灰度值分別是造影前的3.95倍和4.44倍；7 d時分別為3.51和4.03倍；56d時分別為2.98和3.92倍。兩種濃度造影劑在注射后56d內(nèi),小鼠肝臟感興趣區(qū)的平均灰度值與注射前相比均維持在較高的水平，B組小鼠在造影劑注射后各掃描時間點肝臟感興趣區(qū)的平均灰度值顯著高于A組小鼠(P< 0.05)。

A組和B組小鼠在三維重建后，選取各時間點的冠狀位圖片進行比較(圖2和圖3)。結(jié)果顯示：A組和B組小鼠在注射造影劑后各時間點肝臟的對比度明顯高于注射前，兩組小鼠在注射造影劑后24 h的圖像對比度在各個時間點中為最高，肝臟實質(zhì)和邊緣輪廓均非常清楚。兩組小鼠在造影劑注射后56 d內(nèi)肝臟仍然保持很高的增強，B組小鼠在造影劑注射后各掃描時間點肝臟增強均高于A組小鼠。

圖2 A組小鼠靜脈注射ExiTron nano 12000造影劑前后冠狀位圖像

圖3 B組小鼠靜脈注射ExiTron nano 12000造影劑前后冠狀位圖像

2.2 肝癌模型小鼠Micro-CT活體動態(tài)監(jiān)測

C組小鼠在注射造影劑前和注射后各時間點進行Micro-CT活體掃描，三維重建后選取小鼠各時間點的圖片進行比較(圖4，彩插13)。冠狀位圖像可以看到在注射造影劑后3min～56d期間肝臟的對比度明顯高于注射前，而24h、7d、14d、28d和56d均能非常清楚的看到肝臟癌性結(jié)節(jié)的存在(圖中紅色箭頭)。肝癌模型小鼠肝臟組織學(xué)觀察。

HE染色：C組小鼠進行病理學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)肝臟出現(xiàn)非典型性增生，腫瘤細胞核大，染色質(zhì)加深(圖5A、圖5C)，肝臟大片狀出血，炎細胞浸潤，肝細胞壞死(圖5B、圖5D)等典型特征。顯示C組小鼠肝臟存在肝癌相關(guān)病理學(xué)表現(xiàn)(圖5見彩插13)。

3 討論

腫瘤疾病的研究一直受到醫(yī)學(xué)研究者的關(guān)注, 在目前的研究中動物腫瘤模型的應(yīng)用越來越廣泛。肝癌的形成歷經(jīng)啟動、促進、進展和癌變的過程，是一個涉及多因素、多步驟和多階段的復(fù)雜過程。肝癌模型包括自發(fā)性腫瘤模型、移植性腫瘤模型、誘發(fā)性腫瘤模型和人體腫瘤的異種移植性腫瘤模型共4種[5-6]。

大量證據(jù)表明，慢性乙型肝炎患者罹患肝細胞癌的幾率大大升高。Chisari等[7]發(fā)現(xiàn)，表達HBV大S抗原的轉(zhuǎn)基因小鼠在12月齡以后會自發(fā)形成肝臟腫瘤，且雄性患腫瘤的幾率高于雌性。本研究所用的HBV轉(zhuǎn)基因小鼠即為Chisari等報道的50-4品系。此品系易發(fā)肝腫瘤的表型在本研究中得到了驗證。小動物X射線計算機掃描系統(tǒng)(Micro-CT)是專門為小動物設(shè)計和開發(fā)的，由于它具有臨床CT所不具備的高分辨率和容積成像技術(shù)，并能夠以非侵入的方式結(jié)合造影劑后，可實時監(jiān)測腫瘤的轉(zhuǎn)移、發(fā)生和發(fā)展等指標(biāo)，從而能夠動態(tài)追蹤腫瘤藥物的治療及預(yù)后[8-20]，使其逐漸成為臨床前研究的一個有力選擇。

本實驗所使用的新型造影劑為一種基于堿土金屬的納米級造影顆粒，該種顆粒的直徑平均為110 nm，靜脈注射后此種造影劑可以進入網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)，在肝臟可被巨噬細胞和枯否氏細胞吞噬。由于正常肝臟富含網(wǎng)狀內(nèi)皮細胞，而腫瘤內(nèi)無或少含該類細胞，因此造影劑能夠增加腫瘤和肝實質(zhì)之間的對比度[21]。

從結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)：兩組正常小鼠在注射不同濃度的納米顆粒造影劑后，小鼠肝臟均具有很好的顯影效果，24h增強效果到達峰值，同時該新型納米顆粒造影劑能使小鼠肝臟的增強程度在56d內(nèi)仍然保持在一個很高的水平。B組效果顯著好于A組，提示注射100 μL劑量的ExiTron nano 12000更有利于長期觀察。臨床上廣泛使用的非離子型造影劑是通過靜脈注射進行顯影，但其代謝速度較快，不利于腫瘤的長期監(jiān)測。

在HBV轉(zhuǎn)基因肝癌模型小鼠的連續(xù)影像學(xué)監(jiān)測中可清楚地觀察到肝臟癌性結(jié)節(jié)存在，取模型小鼠肝臟進行組織切片染色，發(fā)現(xiàn)肝臟出現(xiàn)非典型性增生，腫瘤細胞核增大，染色質(zhì)加深，肝臟大片狀出血，炎性細胞浸潤和肝細胞壞死等肝癌相關(guān)的病理學(xué)改變，表明該納米顆粒造影劑可以在肝癌模型小鼠活體內(nèi)較好地顯示肝臟腫瘤的存在情況。

總之，本研究通過靜脈注射新型納米顆粒造影劑，成功建立了肝臟腫瘤Micro-CT活體造影成像方法，可以為肝腫瘤小鼠提供快速、清晰和較長時間的連續(xù)無創(chuàng)性監(jiān)測，從而為研究肝癌發(fā)病原因、致病機理和腫瘤藥物的篩選提供有力的技術(shù)保障。

(本文圖4,5見彩插13)。

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