邱望仁 鄒國(guó)英 查娟娟 霍立田

(景德鎮(zhèn)陶瓷學(xué)院信息工程學(xué)院，江西 景德鎮(zhèn) 333403)

0 引言

在整個(gè)生物發(fā)展過(guò)程中，蛋白質(zhì)翻譯后修飾可以協(xié)調(diào)并控制絕大多數(shù)蛋白的活躍程度，正是因?yàn)橛械鞍踪|(zhì)翻譯后修飾，使得一個(gè)基因并非只對(duì)應(yīng)一個(gè)蛋白質(zhì)，從而賦予了人類生命過(guò)程更多的復(fù)雜性。因此對(duì)這一過(guò)程的蛋白進(jìn)行注解變得不容或缺。在基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)和對(duì)疾病機(jī)理的研究中，熟知人類在各階段的生長(zhǎng)發(fā)育期及心理、病理發(fā)生改變的原因和情況對(duì)研究各類基因進(jìn)行細(xì)胞表達(dá)所具有特征擁有特別意義。對(duì)這一方面的探究或許能發(fā)現(xiàn)與存在特殊的心理及病理狀態(tài)有聯(lián)系的分子，而這些分子為將來(lái)構(gòu)思針對(duì)于特定靶分子的藥用蛋白打下了良好根基。因此，了解蛋白翻譯后修飾的原理、種類及作用對(duì)防患重大癌癥有特殊功效。

1 常見的翻譯后修飾的類型及生物功能

蛋白質(zhì)的翻譯后修飾進(jìn)程具有繁雜性及多樣性，現(xiàn)今在對(duì)真核生物的探究中，就發(fā)現(xiàn)了20多種不同的修飾范例。在目前的探究發(fā)現(xiàn)，比較常用的類別就有甲基化、乙酰化、糖基化、磷酸化、酯基化以及近年發(fā)現(xiàn)的泛素化與SUMO化這七種［1］。

1.1 甲基化

甲基化是指從活性甲基化合物(如S-腺苷基甲硫氨酸)上將甲基催化轉(zhuǎn)移到其他化合物的過(guò)程?？尚纬筛鞣N甲基化合物，或是對(duì)某些蛋白質(zhì)或核酸等進(jìn)行化學(xué)修飾形成甲基化產(chǎn)物。甲基化是蛋白質(zhì)和核酸的一種重要的翻譯修飾，調(diào)節(jié)基因的表達(dá)和關(guān)閉，與癌癥、衰老、老年癡呆等許多疾病密切相關(guān)，是表觀遺傳學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容之一。最常見的甲基化修飾有DNA甲基化和組蛋白甲基化［2］。

1.2 乙酰化

乙酰化其主要講把一種乙酰官能基團(tuán)添加到另一種有機(jī)化合物上，并進(jìn)行結(jié)合的過(guò)程。

蛋白質(zhì)中的賴氨酸乙酰化修飾調(diào)控蛋白質(zhì)的多種性質(zhì)，包括DNA-蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、亞細(xì)胞定位、轉(zhuǎn)錄活性等［3］。除了這些重要的生物學(xué)功能以外，賴氨酸乙酰化蛋白質(zhì)及其調(diào)控酶與衰老及幾種重大疾病(如癌癥、心血管疾病、神經(jīng)變形紊亂等)緊密相關(guān)。最近，Kim Orth及其同事在研究耶爾森菌屬的效應(yīng)因子YopJ(一個(gè)細(xì)菌毒力因子)時(shí)，發(fā)現(xiàn)在真核生物中存在著一種重要的翻譯后修飾形式:絲氨酸和蘇氨酸的乙酰化修飾。絲氨酸和蘇氨酸的磷酸化和O-糖基化修飾可以導(dǎo)致細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制的重大改變，Kim Orth及其同事發(fā)現(xiàn)在YopJ中，絲氨酸和蘇氨酸的乙?；揎椗c這些氨基酸的磷酸化修飾相互競(jìng)爭(zhēng)，從而改變細(xì)胞的信號(hào)通路機(jī)制。

1.3 糖基化

糖基化的過(guò)程主要是在糖基轉(zhuǎn)移酶的幫助下，使低聚糖以糖苷的方式移動(dòng)到蛋白質(zhì)分子上，并與蛋白質(zhì)分子上特定的氨基酸殘基進(jìn)行共價(jià)結(jié)合作用而構(gòu)成糖苷鍵的經(jīng)過(guò)。蛋白質(zhì)發(fā)生糖基化反應(yīng)，從而有糖蛋白這種物質(zhì)的產(chǎn)生，此過(guò)程一般在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上發(fā)生，并且糖基化擁有很多功效，主要是對(duì)調(diào)控蛋白質(zhì)發(fā)生修飾和改善蛋白質(zhì)的生物作用［4］。

1.4 磷酸化

蛋白質(zhì)磷酸化指由蛋白質(zhì)激酶催化的把ATP或GTPγ位的磷酸基轉(zhuǎn)移到底物蛋白質(zhì)氨基酸殘基(絲氨酸、蘇氨酸)上的過(guò)程，是生物體內(nèi)一種普通的調(diào)節(jié)方式，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的過(guò)程中起重要作用。蛋白質(zhì)進(jìn)行磷酸化是所有生物中進(jìn)行的最廣泛、最獨(dú)特，并且亦是最具效率的一類蛋白質(zhì)翻譯后修飾進(jìn)程。在生物體中，進(jìn)行磷脂化修飾的蛋白只有三分之一，別看這個(gè)數(shù)目小，但其實(shí)相對(duì)其他修飾而言其修飾是非常龐大的。并且研究發(fā)現(xiàn)，有幾百種磷酸激活酶已經(jīng)被人類基因翻譯及轉(zhuǎn)錄過(guò)［5］。其與多個(gè)生理有關(guān)，并和疾病的產(chǎn)生過(guò)程有一定的聯(lián)系，如:神經(jīng)的活躍、信號(hào)的傳導(dǎo)、細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育、腫瘤癌的產(chǎn)生及肌肉頻繁萎縮等。

1.5 酯基化

蛋白質(zhì)酯基化的一般作用過(guò)程是利用氧和硫原子使脂鏈連接到蛋白物質(zhì)上，從而形成脂蛋白的綴合物，在這個(gè)進(jìn)程中常會(huì)有蛋白分子內(nèi)所含的半胱氨酸發(fā)生法呢基烷基化，或者棕櫚?；阴；?，其作用位點(diǎn)通常是硫鍵。硫和氧原子被修飾的脂鏈能改變所結(jié)合蛋白的功能，因?yàn)檫@個(gè)蛋白中的生物磷脂膜能與脂鏈相互吸引并溶合，所以此蛋白會(huì)被牽制在細(xì)胞膜上不能動(dòng)彈，其功能也就受到限制及改變。

由于具有脂鏈的蛋白能促使其在特定的細(xì)胞膜上進(jìn)行固定，而且能夠調(diào)控此蛋白施展其有益及高效的生物作用［6］。最近幾年，有科學(xué)家證明，脂蛋白綴合物要想正常發(fā)揮其生物功能，必須首先被吸收到細(xì)胞膜上才可以，所以蛋白酯基化的作用是不容忽視的。

1.6 泛素化

泛素化是指泛素分子在一系列特殊的酶作用下，將細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)分類，從中選出靶蛋白分子，并對(duì)靶蛋白進(jìn)行特異性修飾的過(guò)程。蛋白質(zhì)泛素化作用是后翻譯修飾的一種常見形式，該過(guò)程能夠調(diào)節(jié)不同細(xì)胞途徑中各式各樣的蛋白質(zhì)泛素蛋白底物。泛素化在蛋白質(zhì)的定位、代謝、功能、調(diào)節(jié)和降解中都起著十分重要的作用。同時(shí)，它也參與了細(xì)胞周期、增殖、凋亡、分化、轉(zhuǎn)移、基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、信號(hào)傳遞、損傷修復(fù)、炎癥免疫等幾乎一切生命活動(dòng)的調(diào)控。泛素化與腫瘤、心血管等疾病的發(fā)病密切相關(guān)［7］。因此，作為近年來(lái)生物化學(xué)研究的一個(gè)重大成果，它已然成為研究、開發(fā)新藥物的新靶點(diǎn)。

1.7 SUMO化

SUMO(small ubiquitin—related modifier)分子結(jié)構(gòu)和SUMO化反應(yīng)途徑都與泛素相似，都參與蛋白質(zhì)翻譯后修飾，SUMO化修飾與泛素化修飾二者的功能上完全不同。SUMO化修飾可參與轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、核轉(zhuǎn)運(yùn)、維持基因組完整性與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多種細(xì)胞內(nèi)活動(dòng)，是一種重要的多功能的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式。和泛素化不同的是SUMO化修飾不會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的降解，但作用于不同底物會(huì)產(chǎn)生不一樣的影響，也就是說(shuō)，SUMO化修飾的后效取決于它作用的底物［8］。但是它們都是一些重要的細(xì)胞調(diào)節(jié)蛋白。SUMO生物功能表現(xiàn)在以下6個(gè)方面:(1)蛋白的亞細(xì)胞定位;(2)轉(zhuǎn)錄活性調(diào)控;(3)蛋白穩(wěn)定性調(diào)節(jié);(4)細(xì)胞周期調(diào)控;(5)維持基因組完整性;(6)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控。

2 研究方法及關(guān)鍵技術(shù)

2.1 甲基化研究方法及關(guān)鍵技術(shù)

2.1.1 甲基化特異性的PCR

其基本原理是把所有的基因組DNA用亞硫酸氫鹽進(jìn)行處理，如此做是因?yàn)樯形窗l(fā)生甲基化修飾的胞嘧啶都會(huì)被作用變?yōu)槟蜞奏?，但進(jìn)行甲基化修飾的胞嘧啶則不會(huì)發(fā)生改變［9］。由上面的原理可知，采用不同種類的引物做PCR，即可檢測(cè)出這種微弱的變化，這樣就能確定基因是否存在甲基化。

2.1.2 亞硫酸氫鹽測(cè)序法

它是利用重亞硫酸鹽對(duì)DNA進(jìn)行處理，此過(guò)程會(huì)使沒(méi)有進(jìn)行甲基化的胞嘧啶變?yōu)槟蜞奏ぃM(jìn)行甲基化的基團(tuán)則不會(huì)。然后把經(jīng)作用的物質(zhì)為基礎(chǔ)，加入甲基化特異性的物質(zhì)(primerI)或者非甲基化的物質(zhì)(primerII)，使其進(jìn)行特異性的擴(kuò)增［10］。

2.1.3 高分辨率熔解曲線法

在非CpG島位置設(shè)計(jì)一對(duì)針對(duì)亞硫酸氫鹽修飾后的DNA雙鏈的引物，這對(duì)引物中間的片段包含感興趣的CpG島。若這些CpG島發(fā)生了甲基化，用亞硫酸氫鹽處理后，未甲基化的胞嘧啶經(jīng)PCR擴(kuò)增后轉(zhuǎn)變成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變，樣品中的GC含量發(fā)生改變，從而導(dǎo)致熔解溫度的變化。

2.2 乙?；芯糠椒瓣P(guān)鍵技術(shù)

2.2.1 通過(guò)生物質(zhì)譜鑒定乙?；揎椢稽c(diǎn)［11］

質(zhì)譜技術(shù)通過(guò)檢測(cè)到的肽段的質(zhì)量與預(yù)測(cè)的肽段的質(zhì)量進(jìn)行對(duì)比，如果二者質(zhì)量相差42amu，則認(rèn)為在氨基酸殘基或在蛋白質(zhì)末端發(fā)生乙酰化修飾。通過(guò)從鑒定到的肽段的N末端或C末端逐個(gè)分析得到的b離子或y離子，就可以確定發(fā)生乙?；揎椀陌被嵛稽c(diǎn)。

2.2.2 基于特異性識(shí)別乙?；嚢彼釟埢囊阴；贵w

對(duì)于賴氨酸的乙?；揎?，Kim及其同事用免疫親和純化技術(shù)富集賴氨酸乙?；揎椀碾亩危贖ela細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和線粒體中發(fā)現(xiàn)了195種賴氨酸乙?；揎椀鞍?。但是，賴氨酸乙?；贵w只能特異性識(shí)別賴氨酸殘基發(fā)生修飾的蛋白質(zhì)或肽段，不能檢測(cè)到絲氨酸和蘇氨酸的乙酰化修飾。用特異性識(shí)別絲氨酸或蘇氨酸乙酰化修飾的抗體將大大有利于絲氨酸和蘇氨酸乙?；揎椀牡鞍踪|(zhì)組學(xué)分析。

2.2.3 以標(biāo)記底物為基礎(chǔ)的方法

Yu及其同事在酶GNAT的作用下，用氯代乙酰化CoA與其作用底物L(fēng)12反應(yīng)，導(dǎo)致氯代乙?；疞12的生成。然后將氯代乙?；疞12與熒光素His18俘獲的肽段一起孵育，經(jīng)過(guò)氯消除后，純化后的標(biāo)記的底物通過(guò)熒光自顯影便可看到。

德育教育與知識(shí)教學(xué)是相輔相成的。學(xué)生只學(xué)到知識(shí)而沒(méi)有基本品德的建立，那么我們培養(yǎng)的僅僅是“書呆子”。學(xué)生學(xué)習(xí)成績(jī)不好，但是有良好的思想品德，我相信這樣的學(xué)生也是會(huì)得到社會(huì)的認(rèn)可的。因此，德育教育比知識(shí)教育更為重要，有良好的思想品德作基礎(chǔ)，我們的基礎(chǔ)教學(xué)可以更高效地開展。在實(shí)際工作中，有效開展德育工作可以從以下幾點(diǎn)入手。

2.3 糖基化的研究方法及關(guān)鍵技術(shù)

2.3.1 放射性標(biāo)記法

其過(guò)程分為以下幾步進(jìn)行:首先，是對(duì)所需的糖進(jìn)行特殊標(biāo)記;其次，把處理好的糖加入培育好的細(xì)胞或組織中［12］;最后，就利用放射性自顯影技術(shù)對(duì)其進(jìn)行鑒定。

2.3.2 分子熒光標(biāo)記法

鑒定糖基化蛋白最為普遍和最具效率的技術(shù)當(dāng)屬熒光分子標(biāo)記法，其基本原理是因?yàn)橐徊糠值奶堑鞍讚碛凶园l(fā)光特點(diǎn)，所以能直接采用所檢測(cè)的熒光值說(shuō)明蛋白進(jìn)行糖基化修飾的程度，熒光值是利用熒光分光計(jì)來(lái)測(cè)量的。

2.3.3 電泳法

最古老對(duì)糖蛋白進(jìn)行鑒定的技術(shù)便指電泳法，其包含單、雙向電泳兩種，這兩種技術(shù)能夠鑒定出糖蛋白。日常使用親和電泳比色法和SDS-PAGE法對(duì)糖基化程度的高低及糖基化中是否發(fā)生血紅蛋白的隔離進(jìn)行鑒定［13］。

2.3.4 凝集素標(biāo)記法

2.3.5 抗體標(biāo)記法

抗體標(biāo)記法是針對(duì)糖蛋白所帶糖鏈的類型制備各種抗體，對(duì)糖蛋白進(jìn)行檢測(cè)。

2.3.6 化學(xué)酵素法

生物學(xué)家Khidekel是最早研究此類技術(shù)的，他很早便發(fā)現(xiàn)了一種叫半乳糖基轉(zhuǎn)移酶的物質(zhì)，這種物質(zhì)的功能非常強(qiáng)大，能使糖蛋白自動(dòng)地?cái)y帶含酮基的蛋白毒素抗體。

2.4 磷酸化的研究方法及關(guān)鍵技術(shù)

如今，在對(duì)磷酸化肽和磷酸化蛋白質(zhì)的探究中，對(duì)它們之間富集、分離及檢測(cè)所采用的技術(shù)非常之多，在此主要介紹四類辦法［14］:

2.4.1 免疫沉淀法

此技術(shù)的作用機(jī)制是要制備出一種特殊的抗體，它能對(duì)所有含磷酸化殘基的蛋白進(jìn)行免疫沉淀，從而能高效地鑒定磷酸化蛋白。

2.4.2 流式細(xì)胞儀

實(shí)驗(yàn)證明，流式細(xì)胞儀不僅可以測(cè)試轉(zhuǎn)錄活化基因STAT的活躍性和檢測(cè)信號(hào)傳導(dǎo)的作用，還能利用它檢測(cè)熒光強(qiáng)度，來(lái)分析酪氨酸磷酸化蛋白的濃度大小。

2.4.3 雙向凝膠電泳法

現(xiàn)今國(guó)際上一般是利用2D凝膠電泳對(duì)磷酸化蛋白進(jìn)行鑒定的，此項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)在得到科學(xué)家的廣泛認(rèn)可，及得到普遍的應(yīng)用。

2.4.4 固相金屬親和色譜

研究發(fā)現(xiàn)，這種方法最開始是被應(yīng)用在磷蛋白進(jìn)行親和純化的過(guò)程中，固相金屬和磷蛋白中的磷酸殘基之間具有不錯(cuò)吸引力，從而使得這些離子能夠被固定在糖蛋白上，最后利用IMAC柱就可以聚集那些進(jìn)行磷基化的蛋白質(zhì)，從而對(duì)磷蛋白進(jìn)行了鑒定。

2.5 酯基化的研究方法及關(guān)鍵技術(shù)

就當(dāng)今研究結(jié)果而言，所了解到的蛋白酯基化僅有四類:十四酰化、十六酰化、異戊烯化法呢基化、香葉基香葉基化。

生物學(xué)家Kho使用了tagging-via-substrate方法［15］，其首先對(duì)異戊烯化法呢基團(tuán)進(jìn)行加氮處理，并把它添加到已經(jīng)培養(yǎng)好的小鼠細(xì)胞溶液中，利用小鼠細(xì)胞進(jìn)行新陳代謝這一生物功能，把含氮的法呢基團(tuán)與酯基化作用的靶點(diǎn)相結(jié)合。由于異戊烯化法呢基團(tuán)上的氮基團(tuán)能夠和被生物素所標(biāo)記的三芳基膦脂這種物質(zhì)進(jìn)行作用，所以最后可以采用對(duì)標(biāo)記物進(jìn)行鑒定的方法來(lái)檢驗(yàn)脂蛋白是否產(chǎn)生。

2.6 泛素化與SUMO化修飾的研究方法

一般先利用6xHis這種物質(zhì)對(duì)泛素蛋白進(jìn)行標(biāo)記處理，再利用螯合親與色譜技術(shù)來(lái)聚集來(lái)檢測(cè)泛素化蛋白質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)泛素蛋白的碳尾部為Arg-Gly-Gly的構(gòu)造［16］，若用胰蛋白酶對(duì)它作用并發(fā)生降解反應(yīng)時(shí)，Gly-Gly這個(gè)基因片段仍仍能夠被保留在泛素蛋白的肽鏈結(jié)構(gòu)上，導(dǎo)致肽鏈基團(tuán)的基因片段劇增一百多段，后面再利用串聯(lián)質(zhì)譜法來(lái)檢測(cè)泛素化的作用靶點(diǎn)。

綜上所述，目前所具有的對(duì)泛素蛋白探究的技術(shù)是非常少的，所具有的類型也很單調(diào)。對(duì)泛素蛋白的檢測(cè)、泛素作用靶點(diǎn)的定位以及泛素蛋白本身性質(zhì)的探究方法中，這些技術(shù)還必須進(jìn)行不斷的改進(jìn)和完善。除了泛素化修飾之外，還發(fā)現(xiàn)名為類泛素化修飾，類泛素化修飾(SUMO)是泛素化修飾的又一作用類型，它們之間具有顯著的序列同源性，在多數(shù)條件下，它們都能夠利用類似的作用機(jī)制來(lái)促使蛋白共價(jià)修飾的形成?，F(xiàn)今科學(xué)界中，大量的和蛋白泛素化修飾雷同的探索技術(shù)也都利用到對(duì)類泛素化(Sumoylation)的探究發(fā)現(xiàn)中。

3 翻譯后修飾的研究展望

一方面，由于蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能不管是對(duì)人類還是對(duì)動(dòng)物來(lái)說(shuō)，都有著非常重要的意義，而翻譯后修飾是使蛋白質(zhì)發(fā)揮其重要生物學(xué)功能的基石，所以這也是為什么要對(duì)此方面問(wèn)題的討論花費(fèi)巨大的時(shí)間與精力，及研究如此深入。時(shí)至今日，在生物界中所發(fā)現(xiàn)的翻譯后修飾的種類不計(jì)其數(shù)，已經(jīng)記錄在冊(cè)的就超過(guò)了400多種，并且科學(xué)家們還在不斷地探索發(fā)現(xiàn)。翻譯后修飾存在時(shí)空特異性的特點(diǎn)，主要表現(xiàn)在:若生物的內(nèi)在狀態(tài)發(fā)生變化時(shí)，翻譯后修飾的種類也會(huì)有所改變，其修飾程度還會(huì)隨著環(huán)境的改變而變化，而且某些修飾還是轉(zhuǎn)瞬即逝的，因此，定量研究翻譯后修飾及為重要。另一方面，盡管大規(guī)模翻譯后修飾蛋白質(zhì)的研究已經(jīng)轟轟烈烈的進(jìn)行，我們采用現(xiàn)有的技術(shù)也可以鑒定一定數(shù)量的翻譯后修飾蛋白，但是針對(duì)整個(gè)翻譯后修飾蛋白質(zhì)組學(xué)來(lái)講，這些已作的研究很可能只是滄海一粟。因此翻譯后修飾的種類、過(guò)程以及其生物學(xué)功能還有待于進(jìn)一步的研究和發(fā)現(xiàn)。即便如此，相信隨著科學(xué)的發(fā)展，這類問(wèn)題都將迎刃而解，相信在不久的將來(lái)，新的翻譯后修飾的作用將會(huì)被發(fā)現(xiàn)，定量技術(shù)的發(fā)展應(yīng)用也會(huì)日趨完善，人們對(duì)翻譯后修飾蛋白質(zhì)的認(rèn)識(shí)將更為深刻，這也必將加深人們對(duì)蛋白質(zhì)生物功能多樣性的認(rèn)識(shí)和體內(nèi)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)通路的理解。

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