張明成

（綏化學院 黑龍江綏化 152061）

一、前言

大豆中含有大量的貯存蛋白質(zhì)，其含量可高達40%。根據(jù)沉降系數(shù)的不同，大豆蛋白可分為2 S、7 S、11 S和15 S四種組分，其中，7 S組分中的β-伴大豆球蛋白（β-c o n g l y c i n i n）和11 S組分中的大豆球蛋白（g l y c i n i n）是大豆分離蛋白的主要成分。由于7 S和11 S氨基酸的組成、亞基的結(jié)構(gòu)及其相互作用不同，他們表現(xiàn)出的功能性質(zhì)如乳化性、凝膠型等存在較大差異，與11 S球蛋白相比，β-伴大豆球蛋白蛋白含有的巰基和二硫鍵較少，導致其凝膠保水性和黏結(jié)性較差，而含有的賴氨酸和疏水性氨基酸較多導致其具有較強的表面活性、較好的溶解性、乳化性與穩(wěn)定性[1][2]。段春紅[3]等研究大豆分離蛋白亞基及7 S/11 S比例對肉腸品質(zhì)的影響時發(fā)現(xiàn)7 S/11 S與肉腸的彈性呈現(xiàn)極顯著的正相關(guān)性，與咀嚼性和凝膠強度均呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)性，但與硬度的相關(guān)性不顯著，與得率呈現(xiàn)顯著的負相關(guān)性。

20世紀50年代起至今，人們一直不斷研究7 S與11 S的分離方法，這些方法主要包括堿溶酸提法、冷沉法、鹽析法等，其中堿溶酸提法由于其較好的得率和提純純度一直被視為經(jīng)典的分離方法，但近來也有學者在冷沉的基礎(chǔ)上研究凍融處理的分離方法。

二、超速離心分離法

超速離心根據(jù)沉降系數(shù)劃分大豆蛋白質(zhì)組分，是一種非常直接的方法。Wo l f等人[4][5]用超速離心技術(shù)分析了大豆種子提取蛋白，計算了沉降系數(shù)S,根據(jù)超速離心的光吸收曲線峰谷變化所對應(yīng)的沉降系數(shù)，把大豆蛋白質(zhì)劃分為4個組分，即2 S、7 S、11 S和15 S。由于11 S與7 S分子大小不同，沉降速率存在差異，采用超速離心機可以將他們從溶液中沉淀分離出來。但是，超速離心分離心法對于大規(guī)模分離純化并不是經(jīng)濟高效的方法，僅僅適用于實驗室對7 S或11 S組分進行分析。

三、堿溶酸提分離法

堿溶酸提法利用蛋白質(zhì)組分間在不同溶液中等電點不同，通過調(diào)節(jié)p H值，使蛋白質(zhì)組分逐一沉淀，從而獲取相應(yīng)的提取物。

（一）Thanh 分離法

T h a n h等人[6]基于7 S和11 S在P H值6.1~6.6的溶解度不同研究了一種直接分離7 S和11 S的方法。大量研究表明，11 S球蛋白在P H 6.5中是可溶的，但是在T r i s-H C l緩沖液中，當P H值6.1~6.6時，11 S表現(xiàn)得溶解性下降。T h a n h等人使用含有10 m M2-巰基乙醇T r i s緩沖液（P H 8.0）提取蛋白質(zhì)，加入了離子強度小于0.07的N a C l，利用“鹽溶”的效果增加了11 S組分的得率。在提取過程中添加還原劑如2-M E或S B S目的是穩(wěn)定實驗體系，保持蛋白質(zhì)自然狀態(tài)，破壞組分之間的二硫鍵從而進一步增加獲取組分的純度。調(diào)整P H值至6.4，收集沉淀,并在2~5℃離心分離大豆球蛋白，調(diào)整P H4.8，7 S沉淀，然后再溶解到0.03 MT r i s緩沖液中，調(diào)P H值至6.2，離心后，除去不溶解的聚合物后獲得7 S組分。這種方法可以同時獲取兩種蛋白組分，但是，由于離子強度的不同，一部分7 S類似物會轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x態(tài)，蛋白質(zhì)交叉污染始終是存在的問題。11 S分離組分純度，如果提高組分的純度，需要進一步處理，如凝膠過濾或?qū)游觯珪黾映杀?，而且難以規(guī)?；a(chǎn)。

（二）Nagano 分離法

為了減少中間組分的交叉污染，獲得純度高的分離組分，N a g a n o等人[7]改進T h a n h等人的方法：1.提取液采用P H 7.5的水取代T r i s緩沖液；2.亞硫酸氫鈉作為還原劑代替具有毒性的巰基乙醇；3.調(diào)整三次 P H值（P H 6.4,P H 5.0，P H 4.8）分別得到三種蛋白質(zhì)組分沉淀，去除中間組分，沉淀中間產(chǎn)物的目的是在獲取富含大豆球蛋白的成分后，將上清液中的大豆球蛋白組分盡量沉淀，以獲得更高純度的β-伴大豆球蛋白，中間組分的蛋白質(zhì)得率和固體含量隨著N a C l含量的增加而降低。這種方法得到的兩種蛋白質(zhì)粗組分的純度大于90%。4.加入了N a C l，利用“鹽析”作用，破壞蛋白質(zhì)親水層，促進7 S沉淀。這一方法大大提高了提取組分的純度，但是7 S與11 S組分的得率大大降低。朱曉燁等[8]對N a g a n o法的條件進行了優(yōu)化，浸提液p H 9.0，浸提溫度選擇45℃而不是室溫，采用兩次浸提法，添加還原劑N a H S O3的量增加為0.01 m o l/L。在分離過程中，p H 5.4時除去中間組分，優(yōu)化后的方法其提取率和蛋白純度與N a g a n o法相比得到提高。

（三）Wu 的分離方法

1999年，Wu等人[9]不僅將僅限于實驗室獲取蛋白組分的N a g a n o的方法進行改進，而且研究了一種適合中試規(guī)模生產(chǎn)的提取方法，將分離各步驟中采用的離心速度進行修改，并使用兩步提取代替一步提取，從而提高了產(chǎn)物得率和純度。但是，中試過程沒有使用實驗室操作的方法操作中的膜過濾脫鹽步驟。它所獲得的大豆球蛋白和中間混合組分的得率低于實驗室操作的方法，這可能是由于離心機不同而在離心過程中造成了損失。11 S純度在實驗室規(guī)模和中試規(guī)模條件下分別為95.7%和84.2%，7 S分別為77.6和71.8%。

（四）Liu 等人的分離方法

基于N a g a o和T h a n h方法，L i u等人[10]優(yōu)化了從提取液中分離蛋白的方法，P H調(diào)整至8.5、溫度從上述方法采用的室溫提升至45℃、大豆粉/T r i s-H C l緩沖液的比率以及N a H S O3的濃度均做了調(diào)整，最終獲取的富含7 S和11 S組分的得率分別達到了14.4%和10.7%，與此同時，7 S純度也超過95.5%。司曉霞等人[11]對L i u等所報道方法的關(guān)鍵環(huán)節(jié)進行了進一步的條件優(yōu)化，將S B S的最適濃度確定為0.03 m m o l·L-1；二是在7 S析出之前，通過加水析出、離心法去除一次混雜的11 S球蛋白，這兩個環(huán)節(jié)的條件優(yōu)化最終使得β-伴大豆球蛋白的提取純度達到98%。

四、冷沉法分離

大豆蛋白中7 S球蛋白的含硫氨基酸含量較低，其中β-伴大豆球蛋白的β亞基無含硫氨基酸[6],11 S球蛋白含硫氨基酸含量較高，是7 S球蛋白含硫氨基酸含量的5~6倍，每摩爾11 S球蛋白分子中至少包含20個二硫鍵[12]。E.J.N o h[13]等人發(fā)現(xiàn)冷凍處理的大豆疏水作用加強，分子內(nèi)二硫鍵連接，不論加熱與否，冷凍處理增加了大豆蛋白的疏水性。通過冷凍處理會使二硫鍵交聯(lián)，疏水性增強，從而形成分子聚合物沉淀，在一定程度上實現(xiàn)11 S與其他組分如7 S的分離。Wo l f等[2]在室溫下用離心的方法提取大豆水溶性蛋白，將提取的蛋白質(zhì)水溶液進行冰浴、離心，獲得含11 S的冷沉蛋白達到82%，這就是早期分離提取11 S組分的基本方法，稱為冷沉法(c o o l i n g p r e c i p i t a t i o n)。1967年Wo l f等[4]進一步優(yōu)化“冷沉法”分離提取11 S的條件，通過改進，11 S組分的含量提高至88%。

K a z u h i r o M o r i t a[14]等人研究了豆?jié){中的7 S和11 S球蛋白的凍融分餾機制，采用冷凍、緩凍的方式處理制備的豆?jié){，冷凍時，蛋白質(zhì)和復合物被冰晶包圍，在未凍結(jié)的部分中被濃縮，蛋白質(zhì)分子通過二硫鍵和/或疏水相互作用進一步加強，形成主要由11 S球蛋白和11 S球蛋白-脂質(zhì)復合物組成的聚合物。在解凍階段，聚集體解凍、沉淀，7 S球蛋白由于其高親水性可能會形成可溶性聚集體保留在上清液中。因此，大多數(shù)的11 S球蛋白遷移到下層，并且大部分的7 S球蛋白的保留在解凍豆?jié){的上層。并且發(fā)現(xiàn)每當11 S/7 S比達到或超過0.53，就形成沉淀物，即如果在豆?jié){中球蛋白11 S/7 S比值超過0.53，7 S和11 S球蛋白可以由凍融操作分離。

五、鹽析法分離

（一）Saio等人的分離方法

蛋白質(zhì)與鹽離子的作用一方面可以使蛋白質(zhì)在水中的溶解度增加，另一方面也可因為屏蔽了其表面電荷使其發(fā)生聚沉。S a i o法的原理是基于11 S和7 S球蛋白在鈣鹽溶液中溶解度存在著較大的差異而進行提取分離。脫脂大豆粉采用C a C l2溶液浸提,然后離心，取沉淀物置于40℃水中,調(diào)p H至8~8.2，攪拌2 h,再離心，沉淀物為11 S球蛋白粗提物，第一步中分離的上清液通過調(diào)P H值4.5得到沉淀物為7 S組分。但是，這種分離方法獲得的11 S和7 S純度較低（分別為40.4%和60.5%）[16]。

（二）Deak等人的分離方法

由于11 S與7 S表面電荷密度存在差異，7 S和11 S在同一種鹽的作用下，發(fā)生鹽析時所需鹽的濃度是不同的。D e a k等人使用C a C l2作為沉淀劑，11 S組分在P H 6.4時較7 S組分優(yōu)先與二價陽離子結(jié)合，這種改進后的方法顯著增加了7 S和11 S組分的得率(分別為15.1和23.6%)，但是純度比N a g a n o法低[17]。與此同時，C a2+在p H 6.4時也容易與帶負電荷的植酸（P A）形成不溶性的質(zhì)酸鹽，從而導致植酸（P A）含量的提高[18]，并且當p H高于4.5也易形成P A-C a2+蛋白質(zhì)復合物沉淀，破壞食品的營養(yǎng)價值，T e n g等人[19]使用M g C l2代替C a C l2降低了11 S組分的植酸含量，同時得到令人滿意的得率（22%的11 S和16%的7 S）與純度(88%的11 S和80%的7 S)。

六、結(jié)語

綜上所述，堿溶酸提法作為一種經(jīng)典有效的分離方法廣為應(yīng)用，方法也被不斷改進和優(yōu)化，提取的效果與提取液的溫度、種類、還原劑的種類和濃度、提取組分的P H值、離子強度以及離心速度有密切的聯(lián)系。冷沉法雖然研究較早但是由于提取率和純度不及堿溶酸提法而應(yīng)用較少，近來，凍融法分離也為分離方法提供了新的思路，如將可以提高提取效果的上述影響因素結(jié)合到該方法中，可能會增強冷沉法的提取效果。

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