夏晴

(上海交通大學生命科學技術學院 上海 200030)

傳代細胞株在培養(yǎng)過程中容易感染支原體。感染后細胞不會馬上死亡或出現(xiàn)形態(tài)變化,有些細胞甚至一點變化都沒有,所以往往被研究者忽視[1]。支原體對一般抗生素不敏感,所以污染后去除麻煩?？焖俑咝У臋z出支原體無論在科學研究還是實際生產中都具有重要意義。

1 支原體污染的檢測方法

1.1 培養(yǎng)法[2-3]

此法是將待測細胞株的上清液接入特定液體培養(yǎng)基,經過4-7天的37℃培養(yǎng),根據培養(yǎng)基PH值的變化來判定結果。但因培養(yǎng)基PH值受內外干擾較多,仍需進行第二步培養(yǎng),即將上步培養(yǎng)液接入固體培養(yǎng)基中,繼續(xù)培養(yǎng)。如果確有支原體污染則會有典型的“荷包蛋”式菌落長出。

1.2 DNA染色法[2-3]

DNA染色法具有直觀、高靈敏度、操作簡單等優(yōu)點。首先將指示細胞Vero接種到24孔中,培養(yǎng)1天后在每個孔中接種待測樣品。培養(yǎng)4天。然后經過固定、染色、封片等步驟,并用熒光顯微鏡觀察,最終判定結果。被支原體污染的細胞經染色后,在熒光顯微鏡下除了看到有細胞核以外,在細胞核外與細胞周圍還可以看到許多大小均一的熒光小點,即為支原體的DNA,證明有支原體污染。

有些人將這種方法變化,比如直接染色待測細胞等等,但原理都是利用熒光染液結合A-Trich區(qū)域的特性。盡管染色直觀,利用指示細胞培養(yǎng)可以滿足支原體生長的復雜營養(yǎng)要求,操作簡單,但檢驗周期仍需要5天時間,雖然比培養(yǎng)法的檢驗時間大大縮短,但仍不能滿足生產和科研的及時監(jiān)測要求。另外,DNA染色法最大的弊端在于所污染的支原體必須屬于DNA中A-Trich的種屬,對于精氨酸類的支原體污染檢出效果不佳,要結合培養(yǎng)法才確保結果準確。

1.3 PCR[4-5]

PCR方法檢測支原體,首先要把待測細胞裂解,去除抑制物。根據常見污染細胞的支原體的保守序列16S rRNA設計引物,經過合適的PCR反應程序后,電泳,判定最終結果。PCR檢測的最大優(yōu)點是快捷,通常2小時左右即可得出結果。

目前基于PCR檢測的研究主要集中在如何更好去除抑制物、設計引物、優(yōu)化PCR程序等。此種方法主要問題在于容易造成假陰性和假陽性結果,對于重要樣品的結果判定還需依賴于培養(yǎng)法和DNA染色法。所以到目前為止,筆者仍未看到類似藥典之類的官方檢測方法收錄PCR方法。

2 支原體污染的去除方法[6-8]

一般情況下,一經發(fā)現(xiàn)有支原體污染,最好是及時滅活丟棄。但對于一些珍貴細胞系等被污染后還應難免會考慮將支原體清除。以下列舉了最常用的三種方法。另有其它的去除方法幾乎都是在下面三種方法基礎上的改良和疊加。

2.1 抗生素處理法

抗生素處理目前是最有效、實驗室最常用的一種方法。由于支原體沒有細胞壁,所以培養(yǎng)細胞時通常加入的那些抗生素如青鏈霉素等對其殺傷效果不大。目前市場針對支原體污染的抗生素主要有BM-cyclin、MC-210、Ciprofloxacin、M-lasmocin等。用抗生素處理污染的細胞株時會出現(xiàn)一些問題。如處理周期比較長,如BM-cycling整個處理時間需要21天,處理過程中細胞要進行傳代,這對于那些有限細胞系來說就要謹慎處理了。經使用MC-210處理只需要7天時間,但有一定的復發(fā)率。Ciprofloxacin等相對毒性較大,對細胞損害較大。

2.2 加溫處理法

支原體在56℃條件下,30秒內半數(shù)死亡,在45℃環(huán)境中,l5-30分鐘內全部死亡。將污染了的細胞培養(yǎng)物在41℃持續(xù)加溫,依據支原體種類的不同,加溫時間亦有所不同,直至支原體死亡,培養(yǎng)細胞雖也會發(fā)生形態(tài)的變化,但降到正常溫度后可復原。尤其對于普通蛋制苗中支原體污染是一個簡便易行的方法。

2.3 巨噬細胞吞噬法

此法適用于救治支原體嚴重污染的各種珍貴細胞株,一般經過連續(xù)幾輪的巨噬細胞吞噬處理后,即可消除污染并恢復細胞活力。但由于要經過小鼠腹腔,所以有帶入鼠類病毒污染的可能性。

3 展望

如今,體外傳代細胞株的培養(yǎng)在生物學的生產和科研領域扮演著極其重要的角色。然而細胞株被支原體污染后難以及時察覺,容易給生產和科研帶來嚴重損失。支原體污染的檢測方法既要滿足準確的要求又要即可能的縮短檢測時間。而對于已污染的珍貴細胞株,要選取一種既可靠又便捷的方式來處理。

[1]劉玉琴.體外培養(yǎng)細胞工作中支原體污染及對策[J].中華病理學雜志,2004,33(6):571-572.

[2]吳清壇,蒲榮.固體與液體培養(yǎng)法在鑒別支原體感染的差異性研究[J].醫(yī)學檢驗,2011,8(6):69-71.

[3]趙俊,王興滿,胡勇,陳敬賢,王明麗.動物細胞培養(yǎng)物中支原體污染的檢測[J].安徽農業(yè)科學,2010,38(3):1151-1153.

[4]甘一迪,王銀銀,任芳麗,張旭,田碩,張誠.培養(yǎng)細胞污染支原體的PCR檢測方法的建立及應用[J].中國醫(yī)藥生物技術,2011,6(4):295-298.

[5]張貴剛,劉艷霞.細胞培養(yǎng)中支原體PCR檢測進展[J].動物傳染病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生,2008學術年會:313-316.

[6]劉嵐等.貼壁細胞培養(yǎng)過程中支原體污染的幾種救治方案療效比較研究[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2008,24(8):1221-1222.

[7]杜金玲等.生物制品中支原體污染及清除方法的研究進展[J],2012,46(2):57-60.

[8]高林等.用乙基環(huán)丙沙星重建受豬鼻支原體污染的BHK-21細胞的研究[J].中國畜牧獸醫(yī),2011,38(12):45-49.