郭立明 張雪 厲華明

(1.日照市疾控中心 山東日照 276826;2.日照市第三中學 山東日照 276812;3.日照市衛(wèi)生學校 山東日照 276826)

沙門氏菌是一種常見的人獸共患病原菌,不僅會引起各種動物疾病,而且與人類多種疾病有關,其中由沙門氏菌引起的食物中毒顯得尤為突出。根據(jù)世界衛(wèi)生組織報告, 1985年以來,在世界范圍內,由沙門氏菌引起的已確診的患病人數(shù)不斷增加,在一些歐洲國家已增加五倍以上。而在我國,由沙門氏菌引起的食物中毒屢居首位。據(jù)資料統(tǒng)計,在我國細菌性食物中毒中,70%～80%是由沙門氏菌引起,而在引起沙門氏菌中毒的食品中,90%以上是肉類等動物性產品。這不僅造成了巨大經(jīng)濟損失,而且嚴重威脅著人們的身體健康和生命安全,這使得沙門沙門氏菌的研究和預防顯得極為重要,而沙門氏菌的檢測方法正式這項工作開展的重點。筆者參考了國內外文獻,認為沙門氏菌研究方法主要包括三個方面:傳統(tǒng)標準檢測法、免疫學法和分子生物學法。傳統(tǒng)方法是一種國標貨國際檢測的基本方法,但是它鑒定過程復雜,且耗時較長;免疫法是基于抗體的檢測方法,主要包括酶聯(lián)免疫吸附、斑點酶聯(lián)免疫吸附、免疫熒光標記等,它不僅將檢測時間縮短了一半,且靈敏性高和特異性強;分子生物學法主要是以核酸為基礎的PCR技術,由于靈敏、簡單、快速和特異已被廣泛用于沙門氏菌檢測。

1 傳統(tǒng)標準檢測方法

傳統(tǒng)方法是國標法或國際法的一種基本方法,它方法簡單、準確、可重復性強、有一定的靈敏性,最終能夠分離到細菌純培養(yǎng)物,因而也常常作為其他檢驗方法的準確性、敏感性的參照。傳統(tǒng)方法檢測主要包括五個步驟:前增菌和增菌;分離純培養(yǎng)物;屬和種的鑒定;血清學分型;菌型的判定和結果報告。雖然方法簡單,但是過程復雜,且耗時長,全過程需要5個小時左右才能得出明確的診斷結果。

2 免疫學方法

免疫學方法基本原理是抗原和抗體的特異性結合。首先用分子標記已知的抗體或抗原,其次使得標記抗原或抗體與檢測物反應,通過標記物來觀察是否存在抗原抗體特異性免疫反應,從而判斷出微量沙門氏菌的存在與否。該法不僅將檢測時間縮短了一半,而且具有很高的靈敏性和特異性,主要包括酶聯(lián)免疫吸附、斑點酶聯(lián)免疫吸附、免疫熒光標記。

2.1 酶聯(lián)免疫吸附

酶聯(lián)免疫吸附基本原理是將抗原或抗體預先結合在某種固相載體表面,然后加入受檢樣品和酶標抗原或抗體,使其與結合在固相載體上的抗原或抗體起反應形成抗原抗體復合物,經(jīng)洗滌去除反應液中其他物質,加入酶反應底物后,底物被固相載體上的酶催化變?yōu)橛猩a物,最后通過定性或定量分析有色產物即可確定樣品中待測物質含量。

2.2 斑點酶聯(lián)免疫吸附

Dot-ELISA是以纖維素膜作為固相載體的一種新型免疫檢測技術,其原理與常規(guī)ELISA法相同,可用于抗原或抗體的定性或定量檢測。其與ELISA的不同之處在于:一是將固相載體以硝酸纖維素濾膜、確酸醋酸混合纖維素濾膜、重氮節(jié)氧甲基化紙等固相化基質膜代替,用以吸附抗原或抗體;二是顯色底物的供氫體為不溶性,結果在基質膜上出現(xiàn)有色斑點進行判定。該方法簡便、特異、快速、結果直觀,便于在基層推廣使用。

2.3 免疫熒光標記

免疫熒光抗體技術是根據(jù)抗原抗體反應的原理,先將已知的抗原或抗體標記上熒光素,制成熒光抗體,再用這種熒光抗體作為探針檢測組織或細胞內的相應抗原。在組織或細胞內形成的抗原抗體復合物上含有標記的熒光素,利用熒光顯微鏡觀察標本,熒光素受外來激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光(黃綠色或橘紅色),可以看見熒光所在的組織細胞,從而確定抗原或抗體的性質、定位,以及利用定量技術測定含量。

3 分子生物學方法

分子生物學方法發(fā)展迅猛,在沙門氏菌探測中也發(fā)揮著重要作用,主要包括:聚合酶鏈反應(PCR)技術、基因芯片技術、熒光定量PCR。

3.1 聚合酶鏈反應(PCR)技術

PCR技術是一項體外酶促擴增DNA技術,具有特異性強、敏感性高、操作簡便、快速高效等特點。目前,PCR技術是一種快速、簡便、特異、靈敏檢測沙門氏菌的方法。2005年,汪琦等以全脂奶粉、生牛肉和加工過的雞肉為試驗對象,人為添加沙門氏菌,利用PCR方法快速檢測食品中的沙門氏菌,檢測結果與傳統(tǒng)培養(yǎng)方法系統(tǒng)檢測結果一致,檢出限為100CFU/25g,準確性達100%。

3.2 基因芯片技術

基因芯片是固定有很多已知序列DNA探針的硅片或玻片。將經(jīng)過熒光標記的樣品分子與基因芯片上的DNA探針進行雜交,通過檢測每個探針分子的熒光信號強度以得到樣品分子的數(shù)量和序列信息,從而檢測沙門氏菌是否存在。鑒于基因芯片表面的DNA探針從幾十到幾百萬個不等,因而可以一次性檢測多種沙門氏菌,并同時得到病原菌的耐藥性等情況。

3.3 熒光定量PCR

實時熒光定量PCR技術是廣泛應用于快速檢測的現(xiàn)代方法之一,它不僅實現(xiàn)了對DNA的定量檢測,而且具有較高的敏感性、特異性、可靠性和時效性,且自動化程度高、無污染性,能夠同時完成多種樣品的擴增及定量,適宜于大批量樣品的檢測。

4 結語

經(jīng)過數(shù)十年的發(fā)展,如今沙門氏菌建立起了三大檢測體系:傳統(tǒng)檢測方法、免疫學檢測方法和分子生物學檢測方法。它們都具備各自的優(yōu)勢和不足,且優(yōu)劣彼此互補,從而形成了完整、有效的沙門氏菌檢測方法。與此同時,其優(yōu)劣互補特性也提醒著科學家們需要進一步改進,從而發(fā)展出一種操作更簡單、更可靠、更高效的檢測方法。

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