孫靜娜，劉澤世，王國欣，劉青松，張 征

(1河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，石家莊050031;2容城縣人民醫(yī)院)

鮑曼不動桿菌可以在住院患者中發(fā)生定植，很容易通過交叉感染在醫(yī)院內(nèi)流行，而且多重耐藥鮑曼不動桿菌日趨增多，尤其在ICU、嚴(yán)重?zé)齻》康哪退幘甑某霈F(xiàn)，給臨床抗感染治療帶來很大困難。主動外排泵系統(tǒng)是多重耐藥鮑曼不動桿菌臨床分離菌株產(chǎn)生多藥耐藥性的主要機制之一［1］，參與了鮑曼不動桿菌對氨基糖苷類藥物、β-內(nèi)酰胺類藥物、氯霉素、紅霉素和四環(huán)素的耐藥。本研究對多重耐藥鮑曼不動桿菌在不同臨床科室的分布情況及其外排泵基因型進(jìn)行了分析?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 2012～2013年河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院不同科室送檢的標(biāo)本(包括痰液、尿液及血液等)中分離出的多重耐藥鮑曼不動桿菌共96株(同一患者多次分離到的同一菌株不重復(fù)計數(shù))。取純培養(yǎng)細(xì)菌增菌液1 mL與0.5 mL的50%甘油肉湯混勻，-70℃冰箱保存并備用。標(biāo)準(zhǔn)菌株鮑曼不動桿菌(ATCC 19606)購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心。

1.2 儀器及設(shè)備 Maxwell16核酸提取儀為美國Promega公司產(chǎn)品;Mini-4K/6K微型離心機為珠海黑馬醫(yī)學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;AB 9700PCR擴增儀為美國AB公司產(chǎn)品;DYY-12電泳儀為北京六一儀器廠產(chǎn)品;VilBer LouRMAT凝膠成像系統(tǒng)為法國VILBER LOURMAT公司產(chǎn)品;SIGMA 3-18K臺式冷凍離心機為德國Sigma公司產(chǎn)品。

1.3 試劑 外排泵基因 adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、abeM及16SRNA的引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。DNA提取試劑盒Maxwell16 Cell LEV DNA Purification Kit和 PCR擴增 GoTaq? Green Master Mix、GoTaq? Colorless Master Mix購自美國Promega公司。DNA染色劑Goldview、DNA Ladder Marker購自北京賽百盛公司。瓊脂糖X-gal購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.4 多重耐藥鮑曼不動桿菌在不同臨床科室的分布情況統(tǒng)計 按臨床科室統(tǒng)計96株多重耐藥鮑曼不動桿菌的分布情況。

1.5 多重耐藥鮑曼不動桿菌外排泵基因 adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、abeM 的檢測 用 PCR 技術(shù)檢測。①DNA提取:使用Maxwell16 Cell LEV DNA Purification Kit試劑盒，操作見說明書。②adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、abeM 基因 PCR 引物設(shè)計:根據(jù)GenBank中的各型基因序列并參考文獻(xiàn)［2］自行設(shè)計基因引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。adeB:擴增產(chǎn)物長度約541 bp，引物A為5'-TTAACGATAGCGTTGTAACC-3'(AF370885)，引物B為5'-TGAGCAGACAATGGAATAGT-3'AF370 885);adeR:擴增產(chǎn)物長度約447 bp，引物A為5'-ACTACGATATTGGCGACATT-3'(AY426969)，引物B為5'-GCGTCAGATTAAGCAAGATT-3'(AY426969);adeS:擴增產(chǎn)物長度約544 bp，引物A為5'-TTGGTTAGCCACTGTTATCT-3'(AY426969)，引物 B為5'-AGTGGACGTTAGGTCAAGTT-3'(AY426969);adeJ:擴增產(chǎn)物長度約453 bp，引物 A為5'-ATTGCACCACCAACCGTAAC-3'(AY769962)，引物 B為 5'-TAGCTGGATCAAGCCAGATA-3'(AY769962);adeE:擴增產(chǎn)物長度約504 bp，引物A為5'-GAGCTGAGGATTCTCTATGT-3'(DQ223769)，引物B為 5'-AGTGTGCTCACCATATAGTC-3'(DQ223769);adeM:擴增產(chǎn)物長度約303 bp，引物 A為5'-GTAGGTGTAGGCTTATGGA-3'(AY147867);引物 B為5'-GTACCGAAGTGACTGAAAT-3'(AY147867)。③PCR反應(yīng)體系及條件:PCR反應(yīng)體系(25 μL)配置:DNA模板4 μL，引物 A 和引物 B 各 1 μL，2 × GoTaq? Green Master Mix 12.5 μL，RNase-free 水 6.5 μL。PCR 反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)入循環(huán);94℃變性1 min，55 ℃退火 50 s，72 ℃ 延伸 1 min，共進(jìn)行30個循環(huán);最后72℃延伸5 min。④PCR反應(yīng)產(chǎn)物電泳、判定:緩沖液0.5×TBE，電壓100 V，上樣標(biāo)本量 8 μL，DNA 分子量 Maker(100 bp)8 μL，電泳50 min，置于全自動凝膠圖像成像儀上觀察結(jié)果并照相，出現(xiàn)與目的基因片段分子相當(dāng)?shù)臈l帶判為陽性。

2 結(jié)果

2.1 多重耐藥鮑曼不動桿菌在不同臨床科室的分布 96株多重耐藥鮑曼不動桿菌分布在ICU 52株(54.2%)、呼吸內(nèi)科 18 株(18.8%)、燒傷科 9 株(9.4%)、腫瘤科6 株(6.2%)、普外科4 株(4.2%)、腎內(nèi)科 2 株(2.1%)、心內(nèi)科 2 株(2.1%)、兒科 2 株(2.1%)、精神科1 株(1.0%)，主要分布在 ICU 和呼吸內(nèi)科。

2.2 多重耐藥鮑曼不動桿菌的外排泵基因型 96株多重耐藥鮑曼不動桿菌檢測到adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、adeM 基因者分別有 33、32、33、33、0、33株，陽性檢出率分別為 34.38%、33.33%、34.38%、34.38%、0、34.38%。分布在 ICU 的52株多重耐藥鮑曼不動桿菌檢測到 adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、abeM 基因者分別有 18、16、18、18、0、18 株，陽性檢出率分別為 34.62%、30.77%、34.62%、34.62%、0、34.62%;分布在呼吸內(nèi)科的18株多重耐藥鮑曼不動桿菌檢測到 adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、abeM基因者分別有 9、8、8、8、0、8 株，陽性檢出率分別為50.00%、44.44%、44.44%、44.44%、0、44.44%。

3 討論

由于鮑曼不動桿菌在自然環(huán)境和醫(yī)院環(huán)境中普遍存在，而且具有極強的環(huán)境適應(yīng)能力和快速獲得耐藥性的能力，因而鮑曼不動桿菌是引起院內(nèi)感染的最為重要的機會致病菌之一［3］。鮑曼不動桿菌通過其酶機制、外排泵等極容易形成耐藥菌株［4］。主動外排泵是由菌體細(xì)胞膜表面蛋白組成的，可以將進(jìn)入細(xì)菌體內(nèi)的抗菌藥物經(jīng)外排泵排出到細(xì)胞外，而外排泵的過度表達(dá)引起喹諾酮類、氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物及氯霉素的敏感性降低［5，6］。臺灣學(xué)者 Sun 等［7］研究發(fā)現(xiàn) adeB 的高表達(dá)與鮑曼不動桿菌臨床株對替加環(huán)素的耐藥性有關(guān)。聯(lián)合用藥成為治療多重耐藥鮑曼不動桿菌感染的新選擇，并防止耐藥菌株的產(chǎn)生和醫(yī)院內(nèi)感染的擴散［8～10］。

本研究結(jié)果顯示，96株多重耐藥鮑曼不動桿菌中，分布于 ICU的占54.2%，與李娟等［11］報道來自ICU的鮑曼不動桿菌占66.9%基本一致，表明ICU是多重耐藥鮑曼不動桿菌感染的高發(fā)病區(qū)，可能是與ICU患者自身基礎(chǔ)性疾病較重、免疫力低下、大量使用抗菌藥物、大多數(shù)患者有機械通氣及介入治療的醫(yī)療行為給該菌的感染提供了有利環(huán)境及途徑有關(guān)［12］。分布于呼吸內(nèi)科的多重耐藥鮑曼不動桿菌占18.8%，其他的分布在燒傷科、腫瘤科、普外科、兒科、心內(nèi)科、精神科等多個科室。上述結(jié)果表明，在不同的環(huán)境中，鮑曼不動桿菌的分布不同，在患者病情嚴(yán)重、住院時間長、機體免疫力下降，尤其是長時間機械通氣時，多重耐藥鮑曼不動桿菌的感染逐漸增多。

在本研究中，96株多重耐藥鮑曼不動桿菌外排泵adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、adeM 檢出陽性率分別為34.38%、33.33%、34.38%、34.38%、0、34.38%。Marchand等［13］提出，adeR和adeS的出現(xiàn)可能與adeABC的過表達(dá)相關(guān)，增加了耐藥的概率。Yoon等［14］認(rèn)為，AdeR是一個典型的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子，AdeS激活細(xì)菌組氨酸激酶，二者一起針對外界刺激調(diào)節(jié)目的基因表達(dá)。上述結(jié)果表明，外排泵基因的存在是鮑曼不動桿菌出現(xiàn)多重耐藥的重要機制。

分布在ICU的52株多重耐藥鮑曼不動桿菌中adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、adeM 基因檢出陽性率分別為34.62%、30.77%、34.62%、34.62%、0、34.62%，與總的檢出陽性率基本一致;分布在呼吸內(nèi)科的18株多重耐藥鮑曼不動桿菌中 adeB、adeR、adeS、adeJ、adeE、adeM 基因檢出陽性率分別為50.00%、44.44%、44.44%、44.44%、0、44.44%，與總的檢出陽性率相比高出11.11%～16.67%。這可能與ICU中的醫(yī)護(hù)人員對多重耐藥菌感染防治意識較強、工作更加規(guī)范有關(guān)。

總之，本研究結(jié)果表明多重耐藥鮑曼不動桿菌主要分布在 ICU(54.2%)和呼吸內(nèi)科(18.8%)，其外排泵基因型主要為 adeB、adeR、adeS、adeJ、adeM，這是鮑曼不動桿菌發(fā)生多重耐藥的重要因素。

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