王石健，王彬輝，章文紅，張曉芬，吳 敏

0 引言

抗癲疒間肽(Anti-epilepsy peptide，AEP)是從東亞鉗蝎粗毒液中分離的一種具有生物學(xué)活性的多肽，分子量為8 300 Da，有良好的抗癲疒間作用，具有作用強、用量小、毒性低等特點[1]。但AEP為水溶性大分子蛋白多肽類藥物，很難透過血腦屏障入腦，因此，改變AEP在體內(nèi)分布，增加其在病灶藥物濃度是關(guān)鍵。

聚乙二醇-聚乳酸-聚乙醇酸嵌段共聚物[Polyethyleneglycol-modified poly(d,l-lactide-co-glycolide)，PEG-PLGA]是一種新型的兩親性嵌段共聚物，既可有效延緩藥物釋放，又可顯著改善藥物在體內(nèi)的分布，是具有較強靶向作用的載體。PLGA是一種生物相容性好、可生物降解的高分子材料，在體內(nèi)代謝為H2O和CO2，被FDA批準(zhǔn)用于臨床[2-3]。但PLGA納米粒因其疏水性迅速被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)清除，而采用PEG 修飾PLGA，使PEG-PLGA成為兩親性嵌段共聚物，可延長所載藥物在體循環(huán)中的滯留時間，且制備過程中不使用添加劑，避免了由此產(chǎn)生的毒性[4-5]。本實驗以PEG-PLGA為載體，采用復(fù)乳-溶劑揮發(fā)法制備AEP納米粒。

1 材料

1.1 藥品與試劑 PEG-PLGA(Mw=2000-35000，山東濟南岱罡生物科技有限公司，批號：12132016)；異硫氰酸熒光素標(biāo)記的抗癲疒間肽(Fluorescein isothiocyanate-Anti-epilepsy Peptide，F(xiàn)ITC-AEP，杭州中泰生物技術(shù)有限公司標(biāo)記，批號：CH-1200612)，泊洛沙姆188(Poloxamer 188，德國BASF公司，批號：WPAF538B)，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器 HJ-6B多頭磁力加熱攪拌機(金壇市金偉實驗儀器廠)；Optima超速低溫離心機(美國Beckman公司)；Marvern measurement粒度測定儀(英國馬爾文儀器有限公司)；JEM-1200EX透射電子顯微鏡(日本Jeol公司)；Labconco冷凍干燥機(英國LABCONCO公司)；熒光檢測器(日本Shimadzu公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 FITC-AEP-PEG-PLGA-NPs制備 精密稱取10 mg FITC-AEP溶于10 mL蒸餾水作為水相，100 mg PEG-PLGA溶于2 mL丙酮-乙醇(丙酮-乙醇體積比為3∶1)作為油相，把水相緩慢加入油相中，冰浴條件下超聲60 s(功率500 W，工作1.5 s，間歇2 s)，形成W1/O，為初乳。將初乳加入到泊洛沙姆188水相溶液中，冰浴條件下超聲形成W1/O/W2的復(fù)乳。室溫磁力攪拌復(fù)乳揮去有機溶劑，即得FITC-AEP-PEG-PLGA-NPs溶液。40 000 r/min低溫超速離心60 min(4 ℃)，沉淀物用蒸餾水洗滌3次，凍干即得FITC-AEP-PEG-PLGA-NPs。

2.2 FITC-AEP-PEG-PLGA-NPs含量的測定

2.2.1 熒光測定條件 采用熒光分光光度法測定FITC-AEP-PEG-PLGA-NPs含量：激發(fā)波長：λex=494 nrn；發(fā)射波長：λem=518 nm。

2.2.2 線性關(guān)系 精密稱取FITC-AEP溶于蒸餾水，置10 mL容量瓶中，用蒸餾水溶解，定容，搖勻，并分別稀釋成濃度為0.05、0.25、0.5、1、2、5 μg/mL，按“2.2.1”熒光測定條件測定熒光強度。以藥物濃度X為橫坐標(biāo)、熒光強度Y為縱坐標(biāo)，進行線性回歸。得回歸方程為Y=101.58 X-0.341，r=0.999 8(n=6)。結(jié)果表明，F(xiàn)ITC-AEP在0.05～5 μg/mL范圍內(nèi)與熒光強度呈良好線性關(guān)系。

2.3 FITC-AEP-PEG-PLGA-NPs包封率及載藥量測定 稱取一定量FITC-AEP-PEG-PLGA-NPs凍干粉，記Xt；離心前測定熒光值，記Y1，根據(jù)回歸方程，換算成AEP含量；低溫超速離心(3 ℃，35 000 r/min，40 min)后，測定上清液測定熒光值，記Y2，根據(jù)回歸方程，換算成AEP含量，記X2。按式1、2計算包封率與載藥量。

包封率%=(X1-X2)/X1×100%……式1

載藥量%=(X1-X2)/Xt×100%……式2

X1：NPs中AEP量；X2：NPs中的游離AEP量；Xt：凍干粉量。

2.4 FITC-AEP-PEG-PLGA-NPs制備工藝優(yōu)化 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇FITC-AEP用量(A)、PEG-PLGA濃度(B)、丙酮-乙醇比例(C)、復(fù)乳超聲時間(D)為試驗因素，各因素選取3個水平，按正交設(shè)計表L9(34)安排試驗，正交設(shè)計因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表

以粒徑、包封率與載藥量為考察指標(biāo)，應(yīng)用綜合加權(quán)評分法對正交試驗結(jié)果進行綜合分析，粒徑(y1)、包封率(y2)和載藥量(y3)分別按30%、35%和35%的系數(shù)積分，綜合評分(y)=35×(1-y1/168.2)+30×y2/83.5+35×y3/6.87，通過直觀分析及方差分析，優(yōu)選最佳的工藝，結(jié)果見表2、表3。

表2 正交試驗方案和結(jié)果

表3 方差分析表

由表3方差可知，F(xiàn)ITC-AEP用量(A)、PEG-PLGA濃度(B)、復(fù)乳超聲時間(D)對FITC-AEP-PEG-PLGA-NPs的制備工藝有顯著性影響。綜合各因素K值，確定最佳制備工藝為 A2B3C2D2，即FITC-AEP用量20 mg、PEG-PLGA濃度50 mg/mL、丙酮-乙醇比例3∶1、復(fù)乳超聲時間60 s。

2.5 FITC-AEP-PEG-PLGA-NPs制備工藝驗證 按正交試驗優(yōu)化的工藝制備3批FITC-AEP-PEG-PLGA-NPs，考察工藝穩(wěn)定性，結(jié)果見表4。

表4 制備工藝驗證

2.6 FITC-AEP-PEG-PLGA-NPs形態(tài) FITC-AEP-PEG-PLGA-NPs凍干粉加蒸餾水溶解，溶液滴于銅網(wǎng)上，靜置15 min后用濾紙吸干，以3.0%磷鎢酸溶液于銅網(wǎng)上負(fù)染10 min后，透射電子顯微鏡形態(tài)，見圖1。由圖1可見，F(xiàn)ITC-AEP-PEG-PLGA-NPs呈圓形或類圓形，表面光滑圓整。

2.7 FITC-AEP-PEG-PLGA-NPs體外釋放 采用動態(tài)透析袋法研究FITC-AEP-PEG-PLGA-NPs體外釋藥特性。精密量取FITC-AEP-PEG-PLGA-NPs凍干粉適量(含AEP 1 mg)溶解于pH 7.4 PBS溶液，置于已處理過的透析袋內(nèi)，扎緊袋口，將含藥透析袋置于250 mL釋放介質(zhì)中，37 ℃恒溫水浴振蕩(75 r/min)，于0.1、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12、18、24、48 h取樣0.2 mL，立即補加等量同溫釋放介質(zhì)。按“2.2.1”熒光測定條件測定，并計算累積釋放曲線，見圖2。

由圖2可知，F(xiàn)ITC-AEP-PEG-PLGA-NPs 在pH 7.4 PBS緩沖液中的釋藥行為呈現(xiàn)突釋和緩釋兩個階段，前3 h屬于突釋階段，藥物釋放39.7%左右。隨后釋放趨向平緩，48 h時藥物釋放85.3%。分別用零級動力學(xué)方程、一級動力學(xué)方程、Higuchi方程和Weibull方程對其體外釋藥進行擬合，結(jié)果體外釋放符合Weibull釋放模型，Weibull方程為lnln(1/1-Q)=0.675 4lnt-1.279 3(r=0.991 8)。

圖1 FITC-AEP-PEG-PLGA-NPs透射電鏡照片

圖2 FITC-AEP-PEG-PLGA-NPs體外釋藥曲線

3 討論

3.1 癲疒間是一組因大腦病灶神經(jīng)元過度放電所致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能短暫失調(diào)的腦部疾病，具有慢性、反復(fù)發(fā)作的特點，是神經(jīng)系統(tǒng)的常見病、難治病。AEP從蝎毒粗毒中分離、純化出來，由61個氨基酸殘基組成，藥理研究表明其是一種具有抗癲疒間活性的多肽，對各型癲疒間均具有較強的治療作用，且其與傳統(tǒng)抗癲疒間藥如苯妥英鈉、卡馬西平等相比，具有毒性小、作用強的優(yōu)點，是一種理想的抗癲疒間藥[6-7]。但AEP為水溶性大分子多肽，不易透過BBB到達神經(jīng)中樞發(fā)揮抗癲疒間作用。新型的納米藥物載體用于抗癲疒間藥物的輸送，既可提高抗癲疒間藥的效能，還能降低抗癲疒間藥的毒副作用。

3.2 嵌段共聚物是單一線性共聚物分子中存在兩種或兩種以上結(jié)構(gòu)不同的鏈段單元按照一定序列組成的聚合物。兩親性嵌段共聚物是一種新型的納米藥物載體，具有很高的內(nèi)核載藥容量和獨特的體內(nèi)分布特征，在結(jié)構(gòu)上可以劃分出親水部分和疏水部分。由于這種獨特的化學(xué)結(jié)構(gòu)，在水溶液中能形成具有球形內(nèi)核-外殼結(jié)構(gòu)的共聚物膠束。內(nèi)核可以作為儲存藥物的容器，降低毒副作用，外殼可對藥物起保護作用，提高藥物的穩(wěn)定性，并且達到緩釋作用[5-8]。

3.3 本研究在預(yù)試驗的基礎(chǔ)上，結(jié)合抗癲疒間肽的水溶性性質(zhì)，最終確定W1/O/W2復(fù)乳-溶劑揮發(fā)法。本研究所述復(fù)乳法具體為將載體材料PEG-PLGA溶解在有機溶劑中，將藥物水溶液分散在其中，形成W1/O型初乳，再在攪拌條件下將初乳分散到含有表面活性劑的水溶液中，形成W1/O/W2型乳液。該法制備的納米粒包封率為64.46%，粒徑為100.2 nm，PDI為0.111。分析其原因，可能是因為：①采用本法制備的納米粒由于內(nèi)水相與外水相被油相隔開，可以避免藥物向外水相擴散從而包封率提高；②在外水相中加入的poloxamer188有空間位阻作用，可以阻止納米粒的聚集，增加穩(wěn)定性。

3.4 由體外釋藥曲線可知，F(xiàn)ITC-AEP-PEG-PLGA-NPs在pH 7.4 PBS緩沖液中的釋藥行為呈突釋和緩釋兩個階段：第一階段3 h時藥物釋放39.7%，存在一定突釋現(xiàn)象，可能由于AEP吸附在納米粒表面，或者只是以較弱的鍵連接在納米粒表面，使得藥物從透析袋中釋放比較快；第二階段曲線趨向平緩，48 h時藥物釋放85.3%，可能由于大部分AEP進入納米粒內(nèi)核，隨著載體材料逐漸降解，外液逐步擴散到納米粒內(nèi)部并攜帶藥物向介質(zhì)擴散，釋放AEP?？紤]到PLGA降解速度較慢，同時在釋放過程中外液滲入導(dǎo)致內(nèi)部結(jié)構(gòu)變密，外液滲入受阻，導(dǎo)致AEP釋放速度緩慢，呈現(xiàn)緩釋現(xiàn)象。

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