譚文超

0 引言

鹽酸小檗堿，又名黃連素，廣泛存在于小檗科等4科10屬的許多植物中。該藥具有明顯的抗炎作用。對痢疾桿菌、大腸桿菌、肺炎雙球菌等有明顯的抑制作用。近年的研究還發(fā)現(xiàn)，鹽酸小檗堿具有抗心律失常、高血脂、高血壓的作用和體外抗腫瘤活性[1-2]。該藥在臨床上主要用于腸道感染及菌痢等的治療。近年來，該藥與其他藥物的聯(lián)合應(yīng)用越來越多，如與大蒜素、氧氟沙星等聯(lián)合用于細菌性痢疾的治療[3]，與奧美拉唑和阿莫西林聯(lián)合用于幽門螺旋桿菌的根除[4]。有研究顯示，鹽酸小檗堿可能抑制氟西汀經(jīng)CYP3A4代謝，從而誘發(fā)5-HT綜合征[5]。還有多項研究報道，鹽酸小檗堿可以增加環(huán)孢素A的血藥濃度[6-7]。

細胞色素P450(CYP450)酶是一個結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的同工酶組成的超家族酶系，大多數(shù)藥物在體內(nèi)通過CYP450酶系代謝[8]。許多藥物對CYP450酶可產(chǎn)生抑制或誘導(dǎo)作用，進而影響CYP450酶的量和活性，導(dǎo)致聯(lián)合用藥后藥物間產(chǎn)生相互作用，從而使療效降低或毒性增加[9-10]。因此，了解藥物對CYP450的影響對臨床聯(lián)合用藥的安全性和合理性有著十分重要的指導(dǎo)意義。

本研究在體外采用特異性探針底物(異喹胍、非那西丁、美芬妥英和咪達唑侖)結(jié)合高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS/MS)，研究了鹽酸小檗堿對大鼠肝微粒體的蛋白含量、CYP450酶總量和主要CYP450酶亞型(CYP2D6、CYP1A2、CYP2C19和CYP3A4)活性的影響，旨在為鹽酸小檗堿類藥物合理、安全的聯(lián)合用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 動物 Wistar大鼠，體重200～220 g，購自中國醫(yī)科大學(xué)動物實驗研究中心。

1.2 主要藥品與試劑 鹽酸小檗堿，購自湖北拓楚慷元醫(yī)藥有限公司；異喹胍、4-羥基異喹胍、非那西丁、1-羥基咪達唑侖、美芬妥英和4-羥基美芬妥英購自Sigma公司；對乙酰氨基酚對照品、5-溴尿嘧啶對照品和鹽酸納洛酮對照品，購自中國藥品與生物制品檢定所；咪達唑侖，購自徐州恩華藥業(yè)集團有限責(zé)任公司；還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)，進口分裝，購自北京鼎國生物技術(shù)有限公司；牛血清白蛋白，西德進口分裝，購自上海市浦江應(yīng)用生物化學(xué)研究所。甲醇、乙腈為色譜純，購自美國Fisher公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 儀器 TSQ Quantum Access液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Thermo scientific公司)；UV-2450紫外可見分光光度計(日本島津)。

2 方法

2.1 給藥方案 健康Wistar大鼠18只，隨機分成3組，每組6只，雌雄各半。苯巴比妥誘導(dǎo)組，腹腔注射苯巴比妥鈉75 mg/kg；空白對照組，腹腔注射相同體積生理鹽水；鹽酸小檗堿給藥組，灌胃給予鹽酸小檗堿250 mg/(kg·d)。連續(xù)7 d。

2.2 肝微粒體的制備 實驗前動物禁食24 h。動物拉頸處死，開腹取出肝臟，用濾紙吸干水分，稱重；立即放于冰冷的蔗糖溶液中清洗，用剪刀剪碎，反復(fù)清洗至無血色；加4倍肝重的蔗糖溶液，在冰浴中用組織勻漿機制成勻漿，超聲分散30 s；4 ℃下20 000×g離心20 min；棄去沉淀，上清液在4 ℃下100 000×g離心60 min；棄去上清液，沉淀用焦磷酸鉀緩沖液懸浮均勻，在4 ℃下100 000×g離心60 min，沉淀即為肝微粒體，用Tris-HCl緩沖液懸浮均勻，分裝，于-80 ℃保存。

2.3 蛋白濃度測定 采用Folin-酚法測定蛋白含量[8]。得到的蛋白濃度標(biāo)準曲線為C=0.001 5 A，r=0.998。取肝微粒體樣品用0.5 mol/L NaOH稀釋適當(dāng)倍數(shù)，使其響應(yīng)在標(biāo)準曲線的響應(yīng)范圍內(nèi)，同法測定，以同體積的Tris-HCl緩沖液代替肝微粒體樣品作為空白對照，根據(jù)標(biāo)準曲線計算蛋白濃度。

2.4 CYP450含量測定 根據(jù)Wang等[9]報道的方法測定肝微粒體樣品中CYP450的含量。將肝微粒體樣品用Tris-HCl緩沖液稀釋至0.4 mg/mL JP，分別取2.5 mL放于樣品池和參比池中；各加入少量Na2S2O4，并輕微攪拌，對樣品池通一氧化碳(CO)氣體30 s，掃描，分別記錄在450 nm和490 nm處的吸收度，然后根據(jù)Beer定律計算CYP450的含量。

CYP450(nmol/mg protein)=A(450-490)×1 000/91×C

其中，A(450-490)為450 nm和490 nm的吸收度之差，C為被測樣品的蛋白濃度(mg/mL)，CYP450-CO結(jié)合物的摩爾消光系數(shù)為91 L/(mmol·cm)。雙樣本測定，計算平均值。

2.5 CYP450酶活性測定

2.5.1 肝微粒孵化 孵化反應(yīng)體系中分別含有0.5 mg大鼠肝微粒體蛋白、5.0 μmoL MgCl2、5.0 μmoL KCl及100 nmoL的特異性底物，以0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)定容至450 μL，于37 ℃預(yù)孵2 min后，加入50 μL NADPH(終濃度為1.0 mmol/L)啟動反應(yīng)。孵育一定時間后取100 μL反應(yīng)液用100 μL冰冷甲醇終止反應(yīng)。各種CYP450酶的特異性探針底物和特異性產(chǎn)物以及孵育時間如表1所示。

2.5.2 代謝產(chǎn)物測定 采用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)方法對生成的特異性代謝產(chǎn)物進行定量分析。每天制備標(biāo)準曲線，根據(jù)標(biāo)準曲線計算未知樣品的濃度。在樣品測試過程中隨行低、中、高3個濃度的QC樣品，QC樣品的總數(shù)不低于該批樣品總數(shù)的5%，QC樣品的計算濃度不得超出其理論值的15%，否則此批數(shù)據(jù)將不被接受。各特異性產(chǎn)物的LC-MS/MS測定條件如表2所示。

表1 各種CYP450酶的特異性探針底物及孵育時間

3 結(jié)果

3.1 鹽酸小檗堿對大鼠肝微粒體蛋白和CYP450含量的影響 大鼠肝微粒體蛋白和CYP450含量如表3所示。與空白對照相比，連續(xù)口服給藥7 d后，鹽酸小檗堿對大鼠肝微粒體蛋白含量和CYP450含量沒有影響。

表2 各探針底物色譜分析條件

表3 鹽酸小檗堿對大鼠肝微粒體蛋白和CYP450含量的影響

3.2 鹽酸小檗堿對肝微粒體CYP2D6、CYP1A2、CYP2C19和CYP3A4活性的影響 見表4。由表4可見，與空白對照組比較，口服給藥7 d后，鹽酸小檗堿給藥組的CYP3A4酶活性明顯降低(P<0.05)，單位時間內(nèi)生成的特異性產(chǎn)物的量是空白對照組的1/2(114.2 vs 218.6)，而CYP2D6、CYP1A2及CYP2C19酶的活性在空白對照組與給藥組之間無顯著意義，并且兩組的值均明顯低于苯巴比妥給藥組。

表4 鹽酸小檗堿對大鼠CYP1A2、CYP2D6、CYP3A4和CYP2C19活性的影響

4 討論

本研究分別利用特異性探針?biāo)幬锓悄俏鞫　愢?、咪達唑侖、美芬妥英，通過比較對照組與給藥組代謝產(chǎn)物的生成速度評價鹽酸小檗堿對CYP1A2、CYP2D6、CYP3A4及CYP2C19活性的影響，本方法結(jié)合LC-MS/MS的快速、高速分離與多探針底物的特異性，適用于研究藥物對CYP450酶活性的影響。此外，本研究選用經(jīng)典的肝微粒體酶誘導(dǎo)劑苯巴比妥作為陽性對照。從實驗結(jié)果可見，苯巴比妥誘導(dǎo)組CYP450蛋白含量和活性明顯高于空白對照組，也證明本實驗中肝微粒體制備方法能夠獲得有活性的肝微粒酶。

參考文獻：

[1] 賈少輝,張春燕,孫珊.中藥鹽酸小檗堿的研究進展[J].濟寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2012,35(4):302-307.

[2] 曾玉琴,胡清,朱建勇,等.黃連素對2型糖尿病患者血清視黃醇結(jié)合蛋白4水平的影響[J].中國醫(yī)藥,2013,8(5):635-636.

[3] 袁耀明,揭盛華.大蒜素聯(lián)合小檗堿治療慢性細菌性痢疾26例[J].醫(yī)藥導(dǎo)報,2005,24(1):48-49.

[4] 焦杰.奧美拉唑,阿莫西林,鹽酸小檗堿聯(lián)合應(yīng)用根除幽門螺旋桿菌的臨床觀察[J].醫(yī)學(xué)理論與實踐,2007,12(2):34-36.

[5] 沈斌,周月紅.3種選擇5-羥色胺再攝取抑制藥代謝性相互作用的處方分析[J].醫(yī)藥導(dǎo)報,2012,31:521-523.

[6] 黃雪珊,楊國鋒,潘禹辰,等.鹽酸小檗堿對心臟移植受者環(huán)孢素A血濃度的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2008,28(8):702-705.

[7] 吳笑春,李罄,辛華雯,等.合用鹽酸小聚堿對環(huán)抱素A人體藥動學(xué)的影響[J].中國新藥雜志,2004,13(5):432-435.

[8] Danielson PB.The cytochrome P450 superfamily:biochemistry,evolution and drug metabolism in humans[J].Current Drug Metabolism,2002,3(6):561-597.

[9] Wang GJ.Drug pharmacokinetics[M].Beijing:Chemical Industry Press,2005,440-441.

[10]Bertz RJ,Granneman GR.Use of in vitro and in vivo data to estimate the likelihood of metabolic pharmacokinetic interactions [J].Clin Pharmacokinet,1997,32(3):210-258.

[11]李艷梅,王剛,黃志,等.細胞色素氧化酶CYP3A4基因多態(tài)性研究進展[J].兒科藥學(xué)雜志,2011,17(6):49-53.

[12]陳健龍,張玉玲,董宇,等.Cocktail探針?biāo)幬锓ㄔu價小檗堿對肝微粒體CYP450酶的抑制作用[J].中國中藥雜志,2013,38(12):2009-2014.