闞 亮,李鐵軍,何 平*

0 引言

白花蛇舌草分布在日本以及中國大陸的南方等地，是茜草科耳草屬的植物，生長于海拔1 800米的地區(qū)，多生長于山地巖石上。其中成藥味苦、淡，性寒。常用于熱癥、腸胃痛、腫瘤、泌尿系疾病、蟲蛇咬傷等疾病的治療[1-3]。最近研究表明，白花蛇舌草的有效成分2-羥基-3-甲基蒽醌對多種腫瘤細胞具有明顯增殖抑制及誘導(dǎo)凋亡作用[4-6]。但是，目前關(guān)于白花蛇舌草抗腫瘤的機制，特別是2-羥基-3-甲基蒽醌對體外培養(yǎng)的白血病細胞沒有進行更深入的研究，不能從根本上對本藥的抗白血病作用及其機制進行解釋。本實驗主要探討X連鎖凋亡抑制蛋白通路在白花蛇舌草的有效成分2-羥基-3-甲基蒽醌誘導(dǎo)的白血病細胞HL-60凋亡過程中的表達，明確其誘導(dǎo)白血病細胞凋亡的分子機制，為開發(fā)新型抗白血病藥物及其臨床應(yīng)用奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 細胞培養(yǎng)試劑購自美國Invitrogen公司;Embelin及其他所有試劑均購自美國Sigma公司；離心機購自德國Eppendorf 公司;流式細胞儀購自美國Backman公司。2-Hydroxy-3-methylanthraquinone購自Hean生物技術(shù)公司(上海，中國)，Shi等[7]已經(jīng)證明了2-Hydroxy-3-methylanthraquinone的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

1.2 HL-60細胞培養(yǎng) 急性早幼粒細胞白血病細胞株HL-60購自中科院細胞所。細胞培養(yǎng)于含10%小牛血清(杭州四季青生物有限公司)的RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3天傳代1次，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。

1.3 2-羥基-3-甲基蒽醌作用于HL-60細胞 當(dāng)2-羥基-3-甲基蒽醌的濃度為50 μm時，分別培養(yǎng)0、24、48及72 h。

1.4 Hoechst 33258熒光染色觀察細胞形態(tài)學(xué)改變 HL-60細胞以50 μm 2-羥基-3-甲基蒽醌處理0、24、48及72 h后，4%多聚甲醛固定20 min，1 mg/mL的Hoechst 33258避光染色10 min 后封片避光，熒光顯微鏡下觀察后照相并計數(shù)500個細胞核，計算凋亡百分率。

1.5 Annexin V FITC/PI雙染流式細胞儀分析細胞凋亡 HL-60細胞的凋亡率用流式細胞儀檢測。106細胞加入含有Annexin V 的60 μL 結(jié)合緩沖液4℃避光15 min。為了區(qū)別早期凋亡和晚期凋亡或壞死細胞，細胞在檢測前同時染Annexin V 和PI。細胞結(jié)合Annexin V FITC 和PI 后，其結(jié)果采用CellQuest軟件用流式細胞儀進行分析(FACS Calibur，BD Biosciences)。每個樣品至少計數(shù)10 000個細胞。

1.6 Western blot檢測Survivin、Smac、XIAP、cXIAP1/2等蛋白的表達 HL-60細胞經(jīng)處理一定時間后，用PBS 洗滌3次，沉淀物在冰上用裂解液重懸20 min。等量蛋白用12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。通過電轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜，轉(zhuǎn)膜時間為 2 h。2%脫脂奶粉室溫封閉1 h,2%脫脂奶粉稀釋一抗，4 ℃孵育過夜；TBST 洗膜 2 次，0.5×封閉液洗膜 2 次，每次15 min；1%脫脂奶粉稀釋二抗(1∶6 000)，室溫孵育1 h；TBST 洗膜4 次，每次15 min，TBS 洗 2 次，每次15 min。用抗β-actin 抗體標(biāo)記。所有測量結(jié)果用抗β-actin 蛋白標(biāo)志標(biāo)準(zhǔn)化。按PIERCE 化學(xué)發(fā)光試劑盒說明，用發(fā)光試劑浸潤PVDF 膜，X 線膠片在感光屏內(nèi)曝光成像，結(jié)果在凝膠成像儀上照相。同一實驗重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 Hoechst 33258熒光染色 Hoechst 33258將細胞核染為紫藍色，正常細胞核呈均勻彌散熒光，凋亡細胞核呈顆粒狀熒光或濃染塊狀。對照組的HL-60細胞多數(shù)呈均勻彌散熒光，經(jīng)50 μm 2-羥基-3-甲基蒽醌處理48 h后，細胞核濃染邊集及碎裂比例較多(見圖1)。

2.2 流式細胞儀分析急性早幼粒細胞白血病細胞株HL-60的凋亡情況 50 μm 2-羥基-3-甲基蒽醌作用于人白血病細胞株HL-60后發(fā)生凋亡，并且早期凋亡率及總凋亡率均隨著2-羥基-3-甲基蒽醌作用時間的延長而升高。作用24、48及72 h后，早期凋亡率和總凋亡率與0 h比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.001)，結(jié)果見圖2。

2.3 2-羥基-3-甲基蒽醌對Survivin、XIAP、cIAP1/2和Smac等表達的影響 2-羥基-3-甲基蒽醌作用不同時間后，免疫印跡法檢測Survivin、XIAP、cIAP1/2和Smac的表達。結(jié)果顯示，隨著作用時間的延長，XIAP和cIAP1/2的表達逐漸下降，Smac的表達逐漸增加，而Survivin的表達不變，結(jié)果見圖3。

圖1 Hoechst 33258 熒光染色檢測人白血病細胞株HL-60細胞凋亡

圖2 Annexin V FITC/PI雙染流式細胞儀檢測人白血病細胞株HL-60細胞的凋亡情況

圖3 2-羥基-3-甲基蒽醌對Survivin、XIAP、cIAP1/2和Smac等表達的影響

3 討論

凋亡 抑 制 蛋 白(Inhibitor of apoptosis protein，IAP)是一類在結(jié)構(gòu)上具有同源性的細胞內(nèi)源性凋亡抑制蛋白家族，能夠?qū)垢鞣N凋亡誘導(dǎo)因素，抵抗細胞凋亡，與腫瘤的關(guān)系十分密切[8-10]。第二個線粒體衍生的半胱天冬酶激活蛋白(Second mitochondria-derived activator of caspase，Smac)是一種線粒體膜間隙蛋白，通過去除IAPs對半胱氨酸蛋白酶Caspase的抑制作用，從而促進細胞的凋亡[11-12]。

隨著對中醫(yī)藥抗腫瘤作用研究的不斷深入，中藥在白血病臨床治療中的效果越來越受到關(guān)注[13-14]?，F(xiàn)已有不少學(xué)者將白花蛇舌草及其有效成分用于抗白血病作用的研究，并取得了一定的進展。白花蛇舌草及其有效成分藥理作用廣泛，可以抑制腫瘤細胞增殖，阻止細胞周期進展并誘導(dǎo)細胞凋亡。研究證明，白花蛇舌草醇提物及其化學(xué)成分2-羥基-3-甲基蒽醌能夠以時間和劑量依賴的方式誘導(dǎo)人白血病細胞株U937和 THP-1 細胞凋亡，并且U937和 THP-1細胞凋亡的機制涉及磷酸化Akt表達下調(diào)；Caspase-3和Caspase-9的活性隨著感染時間的延長而增加，而加入PI3K的抑制劑可使其活性和U937 細胞的凋亡率增加；加入Caspase-3和Caspase-9的抑制劑可抑制其活性和U937細胞的凋亡率，說明PI3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和Caspase-3和Caspase-9在白花蛇舌草醇提物及2-羥基-3-甲基蒽醌誘導(dǎo)的U937和 THP-1細胞凋亡過程中起重要作用[15]。研究表明，白花蛇舌草醇提取物及水提取物能夠抑制人類紅白血病細胞(K562細胞)的生長并且誘導(dǎo)其凋亡[16-17]。本課題組在國內(nèi)率先發(fā)現(xiàn)，白花蛇舌草的有效成分2-羥基-3-甲基蒽醌通過Fas/FasL和Caspase-8通路誘導(dǎo)人白血病THP-1細胞的凋亡[18]。

在本研究中，筆者應(yīng)用2-羥基-3-甲基蒽醌所致的凋亡人白血病細胞HL-60作為研究模型，探討Survivin、XIAP、cIAP1/2和Smac在此過程中的作用。結(jié)果顯示，隨著作用時間的延長，HL-60細胞凋亡率逐漸增加，XIAP和cIAP1/2蛋白的表達逐漸下降,而Smac蛋白的表達逐漸增加。

總之，本研究結(jié)果表明，Smac、XIAP和cIAP1/2在白花蛇舌草的有效成分2-羥基-3-甲基蒽醌誘導(dǎo)的人白血病細胞凋亡過程中起著重要作用，進一步提示了2-羥基-3-甲基蒽醌誘導(dǎo)白血病細胞凋亡是其抗白血病作用的機制之一，同時也為臨床應(yīng)用2-羥基-3-甲基蒽醌治療白血病提供了實驗基礎(chǔ)。

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