王佳賀,岳冬梅,何 平*

0 引言

金黃色葡萄球菌(簡稱金葡菌，Staphylococcusaureus,S.aureus)是引起醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染最常見的革蘭陽性致病菌[1-3]。研究表明，外界刺激因子對免疫細胞行為的調解主要與細胞內多條信號傳導通路的活化有關[4]。金黃色葡萄球菌感染后，通過Toll 樣受體(TLR)的識別引起炎癥反應，但其信號通路尚未完全闡明。本實驗在原有的工作基礎之上，通過金黃色葡萄球菌感染人巨噬細胞系U937細胞，研究金黃色葡萄球菌對單核巨噬細胞表面TLR4的活化作用；并給予特異性 p38 蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases，MAPKs)的抑制劑，探討針對p38MAPK的干預對TLR4和p38MAPK蛋白表達的影響，觀察TLR4-p38MAPK信號通路的變化，對 TLR4-p38MAPK信號傳導機制與金黃色葡萄球菌感染的關系進行初步探討，為金黃色葡萄球菌所致疾病的治療提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及儀器 細胞培養(yǎng)試劑購自美國Invitrogen公司;p38MAPK 特異性抑制劑SB203580(CalBiochem公司)，以二甲基亞砜(DMSO)溶解，使用前以生理鹽水稀釋，使DMSO 的終濃度為2%，SB203580 的終濃度為5 mg/mL或10 mg/mL；其他所有試劑均購自美國Sigma公司,離心機購自德國Eppendorf 公司；流式細胞儀購自美國Backman公司。

1.2 細胞培養(yǎng) U937細胞在37 ℃、體積分數(shù)5%CO2、100%濕度的條件下，于含有體積分數(shù)10%胎牛血清的RPMI(Roswell park memorial Institute)-1640培養(yǎng)液中進行培養(yǎng)。每2～3天更換新鮮培養(yǎng)液，待細胞在培養(yǎng)瓶約90%時，用培養(yǎng)液將其稀釋3倍，分瓶繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 細菌培養(yǎng) 將凍存于甘油中的金黃色葡萄球菌Wood46按照1∶100的比例接種于CYGP培養(yǎng)基中，37 ℃搖床過夜活化。在金黃色葡萄球菌感染U937細胞0、30、60 和90 min后收集細胞。

1.4 Western blot 檢測TLR4和p38MAPK蛋白的表達 人外周血單核細胞處理一定時間后，用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，沉淀物在冰上用裂解液重懸20 min。等量蛋白用體積分數(shù)12%的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，通過電轉儀將蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜，轉膜時間為2 h。質量分數(shù)2%脫脂奶粉室溫封閉1 h;用TLR4，磷酸化p38MAPK，非磷酸化p38MAPK蛋白等一抗，4 ℃孵育過夜;磷酸鹽緩沖液漂洗3次后加二抗，室溫孵育2 h;化學發(fā)光法顯色，并進行掃描分析，同一實驗重復3次。

1.5 統(tǒng)計學處理 每組實驗均重復3次，采用SPSS 10.0 統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學處理，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間比較用最小顯著差法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 金黃色葡萄球菌Wood46刺激后可以活化U937細胞中TLR4-p38MAPK信號通路 結果顯示，TLR4和p-p38MAPK表達于U937細胞上，見圖1。金黃色葡萄球菌Wood46感染后，TLR4和p-p38MAPK的表達水平隨著感染時間的延長而增加，表明在U937細胞中金葡菌Wood46可以活化TLR4-p38MAPK信號通路。

2.2 P38MAPK信號通路在金黃色葡萄球菌Wood46誘導U937細胞表達TLR4和p-p38MAPK的過程中起著重要作用：當SB203580的濃度分別為5 mg/mL或10 mg/mL時，可以顯著下調TLR4的表達和p-p38MAPK的磷酸化水平(圖 2)。

圖1 金黃色葡萄球菌Wood46誘導U937細胞中TLR4和p-p38MAPK的表達上調

圖2 特異性p38MAPK抑制劑對金黃色葡萄球菌Wood46誘導活化TLR4和p-p38MAPK通路的影響

3 討論

近年來，隨著病原菌與宿主免疫細胞相互作用研究的深入，能夠介導細菌毒力因子抑制或活化宿主細胞內信號分子的細胞表面蛋白日漸成為研究者關注的熱點。TLRs是新近發(fā)現(xiàn)的天然免疫的病原識別受體。它們可以通過廣泛地特異性識別病原微生物，偶聯(lián)信號傳導途徑，并激活天然免疫細胞，最終導致一系列的免疫炎癥反應[5]。TLRs 主要經(jīng)以下兩條信號傳導途徑:TLRs-髓系分化蛋白(MyD88)/白細胞介素-1(IL-1)-受體相關激酶(IRAK)-核因子-κB(NF-κB)誘導激酶(NIK)/NF-κB 途徑;TLRs-MyD88/IRAK-絲裂原活化激酶途徑[5-7]。其中TLR4 是第一個被發(fā)現(xiàn)的哺乳動物TLR，是最具代表性的TLRs受體。研究表明，TLR4 的活化可激活一系列的信號轉導通路，如MAPKs 家族。MAPK級聯(lián)是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，是細胞內的主要信息傳遞系統(tǒng)，可將細胞外信息傳遞到細胞核中，其中，p38MAPK通路是介導炎癥發(fā)生的主要信號轉導通路之一[8-11]。

以往的研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌α-毒素可誘導人單核細胞凋亡，增加 TLR2和 TLR4的表達，在金黃色葡萄球菌的致病過程中起重要作用；我們用α-毒素蛋白純品作用于單核細胞，結果顯示，α-毒素能夠增加c-jun和c-jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK1/2)、p38MAPK的磷酸化水平，證明了MAPK信號通路的成員p38 MAPK和JNK1/2在金黃色葡萄球菌α-毒素的致病過程中起重要作用[12-13]。

本實驗中，我們用含有α-毒素的金黃色葡萄球菌菌株Wood46感染人巨噬細胞系U937細胞，發(fā)現(xiàn)可引起TLR4和p-p38MAPK蛋白表達明顯增高；同時也證明TLR4-p38MAPK信號通路在金黃色葡萄球菌感染的信號傳導中起著重要作用。同時，我們用特異性抑制劑SB203580進行干預，相應地影響TLR4蛋白的表達以及p-p38MAPK蛋白的表達，進一步證明了TLR4-p38MAPK信號轉導途徑與金黃色葡萄球菌感染密切相關。

綜上所述，TLR4-p38MAPK信號轉導途徑參與了金黃色葡萄球菌感染過程，p38MAPK在信號轉導過程中起著重要作用，針對控制TLR4-p38MAPK通路可能成為臨床上防治金黃色葡萄球菌感染的一個新思路。

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