江祖炘，譚 波，代 輝 綜述，王 躍△ 審校

(1.瀘州醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院2011級(jí)，四川 瀘州 646000;2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院骨科，四川 成都 610072)

理論上講，自體軟骨細(xì)胞作為種子細(xì)胞修復(fù)軟骨缺損是較為理想的，但由于軟骨細(xì)胞屬于增殖能力極弱的終末細(xì)胞，傳代能力也十分有限，易出現(xiàn)去分化現(xiàn)象;同時(shí)，來(lái)源廣、分化能力強(qiáng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)作為種子細(xì)胞近年研究較多，但由于定向分化比較復(fù)雜和不穩(wěn)定，分化后形成的軟骨細(xì)胞易出現(xiàn)退化和衰老，因此單獨(dú)的軟骨細(xì)胞和單獨(dú)的BMSCs在組織工程軟骨應(yīng)用中皆受限。國(guó)內(nèi)外有文獻(xiàn)報(bào)道將BMSCs和軟骨細(xì)胞共同培養(yǎng)，使兩種細(xì)胞優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，為優(yōu)化和擴(kuò)大組織工程化軟骨種子細(xì)胞源提供了可能。本文就BMSCs和軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)的原理、方法和存在的問(wèn)題加以綜述，為BMSCs和軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)作為種子細(xì)胞進(jìn)一步的研究提供理論依據(jù)。

1 BMSCs和軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)成軟骨分化原理

成熟軟骨細(xì)胞能分泌含TGF－β1的一系列成軟骨生長(zhǎng)因子，而TGF－β1為誘導(dǎo)BMSCs向軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵物質(zhì)。Liu等［1］通過(guò)豬BMSCs和關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察到軟骨細(xì)胞能分泌TGF－β1、IGF－1等因子并有新生軟骨樣組織形成，說(shuō)明軟骨細(xì)胞可以誘導(dǎo)BMSCs向軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化。而王結(jié)果等［2］發(fā)現(xiàn) BMSCs以旁分泌或自分泌的方式調(diào)節(jié)BMSCs向軟骨細(xì)胞分化，進(jìn)一步完善了共培養(yǎng)的原理。李拉等［3］則認(rèn)為BMSCs有成軟骨分化現(xiàn)象，但并不明顯，而其促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖的作用可能在共培養(yǎng)中起主導(dǎo)作用?？梢钥闯鯞MSCs和軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)成軟骨分化原理除了成軟骨生長(zhǎng)因子外，細(xì)胞間的相互作用也不容忽視。

2 BMSCs和軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)方法

2.1 接觸共培養(yǎng) 接觸共培養(yǎng)也稱混合共培養(yǎng)，為共培養(yǎng)的一種方法，將一定比例的兩種細(xì)胞混合在一起，相互接觸，最終誘導(dǎo)BMSCs向軟骨細(xì)胞分化。馮萬(wàn)文等［4］利用兔自體BMSCs與軟骨細(xì)胞接觸共培養(yǎng)后與脫鈣骨基質(zhì)復(fù)合能有效修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損。說(shuō)明BMSCs能增強(qiáng)軟骨細(xì)胞的增殖，促進(jìn)軟骨細(xì)胞基質(zhì)合成，縮短軟骨細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間和減少傳代次數(shù)，可節(jié)省大量的軟骨細(xì)胞。正常成熟軟骨細(xì)胞能提供成軟骨環(huán)境，而人骨關(guān)節(jié)炎時(shí)軟骨細(xì)胞分泌的骨成形素也能成功誘導(dǎo)BMSCs向軟骨細(xì)胞分化［5］。Wu等［6］的報(bào)道則明確說(shuō)明了接觸共培養(yǎng)中軟骨細(xì)胞提供了BMSCs向軟骨細(xì)胞分化的必要條件，而與BMSCs轉(zhuǎn)化而來(lái)軟骨細(xì)胞無(wú)關(guān)。這可能是新生軟骨細(xì)胞還處于細(xì)胞早期，細(xì)胞功能不全。同時(shí)，F(xiàn)ischer等［7］通過(guò)接觸共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)人關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞通過(guò)分泌甲狀旁腺激素相關(guān)蛋能還能抑制BMSCs的過(guò)度分化。但也有研究認(rèn)為軟骨細(xì)胞對(duì)BMSCs的誘導(dǎo)作用僅限于新生軟骨的形成，而對(duì)于軟骨細(xì)胞外蛋白多糖的聚集和抑制BMSCs過(guò)度分化沒(méi)有作用［8］。

2.2 隔離共培養(yǎng) 隔離共培養(yǎng)是共培養(yǎng)中的另一種方法，將一定比例的兩種細(xì)胞放在一起，但不接觸，細(xì)胞間只有培養(yǎng)液的交換。田力等［9］在體外用含直徑0.22 μm孔的通透膜將兔BMSCs和軟骨細(xì)胞隔離共培養(yǎng)，觀察到軟骨微環(huán)境在BMSCs向軟骨分化及體內(nèi)軟骨形成中具有重要作用，軟骨細(xì)胞能有效地誘導(dǎo)BMSCs向軟骨細(xì)胞分化并促進(jìn)BMSCs體內(nèi)軟骨形成。而 Acharya等［10］則通過(guò) Traswell(插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿，是一類有通透性的杯狀裝置)小室共培養(yǎng)人BMSCs和關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，得出兩種細(xì)胞間有相互作用，BMSCs可以誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞增殖，軟骨細(xì)胞可以誘導(dǎo)BMSCs向軟骨細(xì)胞分化的結(jié)論。對(duì)于軟骨組織形成關(guān)鍵的細(xì)胞外基質(zhì)而言，王萬(wàn)宗等［11］的研究證明氨基聚糖含量隨著誘導(dǎo)時(shí)間增加而增多，提示關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞分泌物具有促進(jìn)BMSCs向關(guān)節(jié)軟骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化的能力。而周峰等［12］的研究則說(shuō)明軟骨細(xì)胞同樣能誘導(dǎo)老年人BMSCs向成軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化。

3 不同誘導(dǎo)方法的比較

3.1 接觸共培養(yǎng)與隔離共培養(yǎng)比較 為比較兩種方法的優(yōu)劣，Bian等［13］用人 BMSCs和軟骨細(xì)胞分別用兩種方法培養(yǎng)，最終發(fā)現(xiàn)接觸共培養(yǎng)比隔離共培養(yǎng)產(chǎn)生的軟骨組織具有更強(qiáng)的生物力學(xué)。細(xì)胞間的相互接觸促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，從而使生成的軟骨組織更接近于正常軟骨組織。但隔離共培養(yǎng)更適合于觀察細(xì)胞各自的變化，是研究共培養(yǎng)原理的理想方法。

3.2 共培養(yǎng)與傳統(tǒng)成軟骨誘導(dǎo)液比較 有學(xué)者將共培養(yǎng)誘導(dǎo)形成的軟骨樣組織和傳統(tǒng)的含TGF－β1等誘導(dǎo)因子誘導(dǎo)的軟骨樣組織進(jìn)行比較。Lettry等［14］利用馬BMSCs和軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)BMSCs能向軟骨細(xì)胞分化，加入TGF－β1后并沒(méi)有提高軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖基因的表達(dá)。呂晶等［15］發(fā)現(xiàn)采用共培養(yǎng)方式誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞，其生物學(xué)特性與采用含TGF－β1的條件培養(yǎng)液誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞相比，前者優(yōu)于后者，如分泌糖胺多糖的能力以及基質(zhì)分泌量均較高。陳宗雄等［16］也發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)誘導(dǎo)的結(jié)果與含10 μg/L TGF－β1的誘導(dǎo)液結(jié)果相當(dāng)，但隨著關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞在誘導(dǎo)體系中比例的增加，誘導(dǎo)結(jié)果明顯優(yōu)于TGF－β1誘導(dǎo)，但這種誘導(dǎo)作用也存在飽和現(xiàn)象?；蛟S是成熟的軟骨細(xì)胞能提供和體內(nèi)更為相似的環(huán)境，所以共培養(yǎng)形成的軟骨組織細(xì)胞外基質(zhì)較多。

4 BMSCs和軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)中存在的問(wèn)題

4.1 兩種細(xì)胞的最佳比例 兩種細(xì)胞的比列是共培養(yǎng)結(jié)果的關(guān)鍵，不同比列的兩種細(xì)胞共培養(yǎng)后可以得到性狀不同的新生軟骨組織，但哪種比列最好，目前還沒(méi)有統(tǒng)一的觀點(diǎn)。Tsuchiya等［17］研究說(shuō)明軟骨細(xì)胞的增殖速度和細(xì)胞外基質(zhì)的合成與BMSCs的比例呈正相關(guān)，但沒(méi)有給出明確比列。Kang等［18］用豬 BMSCs和軟骨細(xì)胞接觸共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)BMSCs和軟骨細(xì)胞為5∶5時(shí)Ki67和Dlk1兩種關(guān)于細(xì)胞增殖和成軟骨潛能的基因含量較其他組高。而Qing等［19］則報(bào)道2∶1(兔BMSCs:兔軟骨細(xì)胞)組Ⅱ型膠原和聚集蛋白聚糖含量顯著高于其他比例組。蔣愷等［20］將混合后的細(xì)胞依次體外及體內(nèi)培養(yǎng)，觀察到BMSCs與軟骨細(xì)胞混合濃度比例以3∶1最好。不同的細(xì)胞比例對(duì)新生軟骨組織的特性影響較大，最佳比例還需進(jìn)一步研究。

4.2 細(xì)胞種植密度、誘導(dǎo)時(shí)間和支架的選擇 細(xì)胞種植密度也是誘導(dǎo)向軟骨細(xì)胞分化的關(guān)鍵。一般認(rèn)為較高密度的細(xì)胞培養(yǎng)有利于細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與基質(zhì)間相互作用以及細(xì)胞之間的信號(hào)傳遞，并能形成低氧濃度的環(huán)境，有利于誘導(dǎo)成軟骨細(xì)胞。并且高密度的細(xì)胞共培養(yǎng)可以延長(zhǎng)所培養(yǎng)的細(xì)胞維持表型不變的時(shí)間［21］。而誘導(dǎo)時(shí)間和支架材料的選擇性較大，目前還很難判斷哪個(gè)最好。吳俊等［22］將5.0×107/ml終濃度的混合細(xì)胞接種于聚羥基乙酸/聚乳酸(PGA/PLA)支架上體外培養(yǎng)8周，然后裸鼠體內(nèi)再培養(yǎng)6周，證明軟骨細(xì)胞能夠誘導(dǎo)BMSCs向軟骨細(xì)胞分化。Meretoja等［23］用 1.25×106/ml終濃度的混合細(xì)胞接種于聚甲基丙烯酸甲酯(PCL)支架上體外培養(yǎng)8周，同樣得出軟骨細(xì)胞能夠誘導(dǎo)BMSCs向軟骨細(xì)胞分化，并且干細(xì)胞能提高軟骨細(xì)胞潛能。不同的種植密度，不同的誘導(dǎo)時(shí)間以及支架等的選擇都會(huì)影響軟骨組織的形成，不同因素的單獨(dú)作用及相互間的作用等都還有待研究。

5 小結(jié)與展望

BMSCs和軟骨細(xì)胞作為種子細(xì)胞都有各自的優(yōu)勢(shì)和不足，BMSCs和軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)，取其兩種細(xì)胞優(yōu)點(diǎn)，并相互彌補(bǔ)不足，為組織工程化軟骨種子細(xì)胞來(lái)源的有效方法。并通過(guò)與傳統(tǒng)的含TGF－β1的誘導(dǎo)液比較得出共培養(yǎng)方式誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞更接近正常軟骨細(xì)胞，更有利于作為組織工程軟骨的種子細(xì)胞并且實(shí)驗(yàn)費(fèi)用也較低，因此BMSCs和軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)與傳統(tǒng)的條件誘導(dǎo)液相比占有一定的優(yōu)勢(shì)［24］。但目前仍存在一些問(wèn)題，共培養(yǎng)原理還需完善，共培養(yǎng)的方法還在不斷更新，以及兩種細(xì)胞的最佳比例、共培養(yǎng)的時(shí)間、細(xì)胞種植密度、三維支架材料的選擇等問(wèn)題仍需要進(jìn)一步探索。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，我們充分相信BMSCs和軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)在組織工程化軟骨的發(fā)展過(guò)程中具有廣闊的應(yīng)用前景。

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