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        果蠅GAL4/UAS系統(tǒng)在本科遺傳學(xué)實驗中的應(yīng)用

        2014-08-15 00:43:15馬沛勤蘇仙絨
        運城學(xué)院學(xué)報 2014年5期
        關(guān)鍵詞:遺傳學(xué)果蠅品系

        馬沛勤,蘇仙絨,陳 莉

        (運城學(xué)院 生命科學(xué)系,山西運城044000)

        隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展,分子遺傳學(xué)、發(fā)育遺傳學(xué)等現(xiàn)代生物學(xué)內(nèi)容編入本科遺傳學(xué)教科書中(如基因轉(zhuǎn)座子遺傳分析、基因表達(dá)調(diào)控、免疫遺傳分析、基因組學(xué)與后基因組學(xué)等),教科書內(nèi)容發(fā)生了轉(zhuǎn)折性的改革。漸漸地,經(jīng)典遺傳學(xué)內(nèi)容部分在教科書中的比重不斷減少,如劉祖洞在1991年主編的《遺傳學(xué)》中,經(jīng)典的三大遺傳規(guī)律內(nèi)容約占38%,而戴灼華在2008年主編的《遺傳學(xué)》中,三大遺傳規(guī)律內(nèi)容約占21%。但是,配合遺傳學(xué)教學(xué)的本科遺傳學(xué)實驗,在地方性院校卻幾十年如一日,仍然停留在驗證遺傳規(guī)律和染色體制片觀察等經(jīng)典遺傳學(xué)內(nèi)容上,反映現(xiàn)代遺傳學(xué)內(nèi)容的實驗并沒有或很少進(jìn)入本科遺傳學(xué)實驗的課堂。究其原因是多方面的,如實驗材料、實驗經(jīng)費、實驗設(shè)備、實驗準(zhǔn)備、實驗操作、實驗學(xué)時及實驗安排等都是限制因素。本實驗改革以2006年張文霞主編的《遺傳學(xué)實驗指導(dǎo)》為參考,嘗試將果蠅的GAL4-UAS系統(tǒng)引入遺傳學(xué)實驗,實現(xiàn)基因的表達(dá)。在本科遺傳學(xué)實驗中引入分子遺傳學(xué)的理念。

        1.GAL4/UAS系統(tǒng)

        GAL4蛋白是酵母中的一類轉(zhuǎn)錄因子,它能夠與特定的上游激活序列(Upstream Active Sequences,UAS)結(jié)合,并驅(qū)動UAS下游基因的表達(dá)。

        1.1 GAL4/UAS系統(tǒng)的表達(dá)調(diào)節(jié)

        半乳糖是通過轉(zhuǎn)化為6-磷酸葡萄糖后進(jìn)入糖解途徑而被酵母利用的。從半乳糖的運輸?shù)?-磷酸葡萄糖的轉(zhuǎn)化,需要C A L Z(透性酶)、G A LI(激酶)、G A L7(轉(zhuǎn)移酶)、G A LI O(差向異構(gòu)酶)和G A L S(變位酶)等的參與。這些gal基因的轉(zhuǎn)錄是被緊密調(diào)控的。gal4基因編碼一種能結(jié)合上述基因上游DNA序列(UAS)并激活這些基因轉(zhuǎn)錄的GA L4蛋白,是一種轉(zhuǎn)錄因子。GAL4蛋白共有881個氨基酸,包括N端的DNA結(jié)合域、轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域、GAL80結(jié)合域、核定位信號區(qū)幾個功能域。UAS是GAL4蛋白的結(jié)合位點,每個UAS含有數(shù)目不同的結(jié)合單元,結(jié)合單元的一致序列為CGGA(GC)GACATCAGGCAGGC[1]。在 G A L4 存在下,UAS是能增加任何基因轉(zhuǎn)錄的模式元件,其相互作用與方向和距離無關(guān),是一種增強子序列。

        1.2 果蠅GAL4/UAS系統(tǒng)的構(gòu)建

        黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)屬于昆蟲綱、雙翅目、果蠅科、果蠅屬,具有許多優(yōu)良的特性。①易于實驗室培養(yǎng),生活周期短,后代多;②每條染色體都有人工構(gòu)建的平衡染色體,抑制重組并便于基因的定位;③攜帶的容易識別的標(biāo)記基因是遺傳篩選必不可少的工具;④巨大唾液腺染色體可直接觀察染色體畸變;⑤雄性果蠅的染色體不會發(fā)生減數(shù)分裂重組;⑥豐富的遺傳工具和不同的突變體庫。這些特點使黑腹果蠅成為重要的遺傳學(xué)研究模式動物。

        果蠅的GAL4-UAS系統(tǒng)是果蠅遺傳學(xué)研究中常用的基因表達(dá)工具之一。1993年,Brand和Perrimon將酵母的GAL4/UAS序列引入到果蠅中,發(fā)明了雙向法,將GAL4作為驅(qū)動者,在上游連接組織性特異表達(dá)基因的啟動子序列,UAS作為應(yīng)答者,在下游連接靶基因,通過顯微注射的方法將這兩部分分別整合在不同的轉(zhuǎn)基因果蠅中。含有UAS-靶基因的轉(zhuǎn)基因果蠅品系,因為沒有驅(qū)動者,靶基因不會在親本中表達(dá),只有在與驅(qū)動者GAL4品系雜交后的子一代中,靶基因才會表達(dá)。這樣在時間上可以控制靶基因的表達(dá)?;虮磉_(dá)的位置和組織取決于GAL4前面連接的組織特異性表達(dá)的啟動子序列[2]。因此利用不同的、特異的GAL4轉(zhuǎn)基因果蠅可以控制靶基因在不同組織的表達(dá)。

        構(gòu)建轉(zhuǎn)基因品系的載體是P因子的骨架。果蠅的P因子(P-element)是果蠅自身的一種轉(zhuǎn)座子,可以在其自身產(chǎn)生的轉(zhuǎn)座酶的作用下,在果蠅的基因組內(nèi)轉(zhuǎn)座。通過剔除P因子內(nèi)轉(zhuǎn)座酶基因,使其成為轉(zhuǎn)基因的載體[3]。PGAWB是基于P因子建立的可以表達(dá)GAL4蛋白的載體,包括gal4基因,hsp70終止子。通過在gal4基因上游插入特異的啟動子,利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以構(gòu)建一系列在不同時期、不同組織內(nèi)表達(dá) GAL4蛋白的果蠅品系。P UAST也是基于P因子的載體,可供插入靶基因。PUAST包含5個UAS重復(fù)片段,hsp70啟動子,多克隆位點,以及SV40小 t內(nèi)含子和 polyA序列[4]。UAS的下游可以連接不同性質(zhì)的基因序列,如連接靶基因的小干擾RNA(siRNA)序列,在GAL4的驅(qū)動下可以達(dá)到基因下調(diào)的目的[5];UAS下游連接綠色熒光蛋白(GFP)基因,可以達(dá)到標(biāo)記特異細(xì)胞的目的。GAL4/UAS系統(tǒng)已成為一種轉(zhuǎn)基因技術(shù)體系。

        1.3 eyeless-GAL4和 UAS-Rasv12轉(zhuǎn)基因果蠅品系

        1.3.1 eyeless-GAL4 轉(zhuǎn)基因果蠅品系

        eyeless-GAL4是只在復(fù)眼內(nèi)特異表達(dá)GAL4蛋白的轉(zhuǎn)基因果蠅品系。

        果蠅的eyeless(ey)基因是果蠅復(fù)眼發(fā)育所必須的基因,與人的Pax基因同源[6](一個在進(jìn)化上相當(dāng)保守的基因家族,它們編碼的產(chǎn)物是一類極為重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子,存在于從果蠅到人類的各種生物體中,參與細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路的調(diào)控,在胚胎發(fā)育過程中對細(xì)胞分化、更新、凋亡起重要的調(diào)控作用,影響器官和組織的形成),在神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及眼睛的形態(tài)發(fā)生過程中起重要作用。果蠅eyeless基因突變會導(dǎo)致眼睛結(jié)構(gòu)上的缺陷或復(fù)眼完全消失。eyeless最早表達(dá)于胚胎時期的神經(jīng)系統(tǒng),在幼蟲階段持續(xù)地影響復(fù)眼發(fā)育。若將eyeless基因異位表達(dá)在復(fù)眼以外的部位,如使用dpp-GAL4(dpp是特異表達(dá)在肢體的基因的啟動子)驅(qū)動UAS-eyeless在果蠅的翅、足及觸角上表達(dá)eyeless基因后,可以觀察到長在翅、足或者觸角上的紅色復(fù)眼小眼面。說明eyeless基因的功能確實是與復(fù)眼的生長發(fā)育相關(guān)eyeless-GAL4表示GAL4蛋白只在復(fù)眼內(nèi)表達(dá)。

        1.3.2 UAS-Rasv12轉(zhuǎn)基因果蠅品系

        UAS-Rasv12轉(zhuǎn)基因果蠅品系是一種含有靶基因ras的UAS果蠅品系。ras基因是研究較為深入的一個原癌基因(oncogene),最早在病毒中發(fā)現(xiàn),后來在人類、果蠅、線蟲、及酵母等生物中也發(fā)現(xiàn)該基因的同源基因。ras基因的產(chǎn)物具有很強GTP結(jié)合作用和GTP酶活性,通過GTP和GDP的相互轉(zhuǎn)化可以有節(jié)制地調(diào)控細(xì)胞的生長、增值和分化等重要生理過程。作為原癌基因的ras基因被激活以后就變成有致癌活性的癌基因,與GTP解離減少,失去GTP與GDP有節(jié)制的調(diào)節(jié),導(dǎo)致細(xì)胞持續(xù)生長,并阻止細(xì)胞的自我毀滅、凋亡[7]。

        基因突變與基因大量表達(dá)都會激活ras基因。ras基因的任何突變都使正常的RAS蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)槟軌蚴筃IH/3T3細(xì)胞(NIH 3T3是由美國國立衛(wèi)生研究院(簡稱NIH)所建立的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞系,其特點是每3天傳代一次,每次接種3×105cells/ml。該細(xì)胞系在實驗室常用來做轉(zhuǎn)染及基因表達(dá)的研究。)轉(zhuǎn)化的蛋白,并在裸鼠中誘導(dǎo)腫瘤的形成。Rasv12為ras基因的一個突變體。在ras基因附近插入一個強起動子(Promoter)或增強子(enhaner)或能被GAL4誘導(dǎo)的UAS,都能使ras基因表達(dá)增強。

        2.GAL4/UAS果蠅系統(tǒng)在遺傳學(xué)實驗中的構(gòu)建與實踐

        實驗題目:GAL4/UAS系統(tǒng)誘導(dǎo)ras癌基因在果蠅復(fù)眼中異位表達(dá)

        實驗材料:黑腹果蠅野生型;黑腹果蠅轉(zhuǎn)基因品系eyeless-GAL4,黑腹果蠅轉(zhuǎn)基因品系UASRasv12。實驗材料由北京大學(xué)張文霞副教授果蠅實驗室提供。

        實驗?zāi)康?了解如何通過GAL4-UAS系統(tǒng)在模式動物黑腹果蠅中實現(xiàn)靶基因的時空表達(dá)。認(rèn)識GAL4-UAS系統(tǒng)在研究果蠅遺傳發(fā)育中的重要性和優(yōu)越性;理解分子調(diào)控、靶基因表達(dá)與個體的遺傳和發(fā)育每個環(huán)節(jié)都是可以操作和控制的現(xiàn)代遺傳學(xué)實驗理念。

        實驗原理:將eyeless-GAL4驅(qū)動者轉(zhuǎn)基因果蠅品系與應(yīng)答者UAS-Rasv12轉(zhuǎn)基因果蠅品雜交,雜合子代體內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子GAL蛋白與UAS序列結(jié)合,誘導(dǎo)下游ras基因在復(fù)眼原基細(xì)胞中表達(dá)。

        實驗器具及試劑:同果蠅雜交實驗。

        實驗步驟:

        ①以eyeless-GAL4或者UAS-Rasv12轉(zhuǎn)基因果蠅品系為母本,另一品系為父本,挑處女果蠅和雄性果蠅各7~8只,放入新鮮培養(yǎng)基中(25℃)培養(yǎng)。

        ②一周后,移去親本,繼續(xù)培養(yǎng)。

        ③至子一代成蟲羽化(ras基因的過量表達(dá)會引起果蠅的生長延滯,因此生活周期較野生型果蠅長),觀察子一代成蟲復(fù)眼與野生型成蟲復(fù)眼的差異[2]。

        作業(yè):拍照F1果蠅復(fù)眼與野生型果蠅復(fù)眼的差異,說明差異的原因。

        3.將GAL4/UAS果蠅系統(tǒng)引入本科遺傳學(xué)實驗的優(yōu)勢

        GAL4/UAS系統(tǒng)誘導(dǎo)ras基因在果蠅復(fù)眼中異位表達(dá)實驗要求與果蠅雜交實驗同步進(jìn)行,不需要增加實驗學(xué)時和專門安排實驗時間,不需要增添任何的儀器設(shè)備與試劑,實驗準(zhǔn)備簡單、省時省工,學(xué)生的實驗操作熟練、結(jié)果準(zhǔn)確。更重要的是:學(xué)生通過對實驗結(jié)果的直接觀察,了解了GAL4-UAS系統(tǒng)的分子調(diào)控機制;理解了基因在的形態(tài)發(fā)生中的作用、基因的調(diào)控作用和表達(dá)方式;認(rèn)識了GAL4-UAS系統(tǒng)在研究果蠅遺傳發(fā)育中的重要性和優(yōu)越性;也認(rèn)識了功能基因組學(xué)研究和基因工程技術(shù)的作用;對分子遺傳學(xué)的認(rèn)識由一個抽象的東西變成一個具體的東西,由一個想象的東西變成一個現(xiàn)實的東西。

        [1]劉巍峰,高東.釀酒酵母GAL基因的表達(dá)調(diào)控[J].微生物學(xué)通報,1998(2).

        [2]張文霞,戴灼華.遺傳學(xué)實驗指導(dǎo)[M].北京:高等教育出版社,2007.

        [3]劉曉雋,袁小京等.用增強子陷阱技術(shù)構(gòu)造并篩選果蠅UAS/GAL4系統(tǒng)中GAL4新品系及腦基因表達(dá)圖譜數(shù)據(jù)庫的開發(fā)[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2008(6).

        [4]李春峰,夏慶友,周澤揚.GAL4/UAS系統(tǒng)在轉(zhuǎn)基因技術(shù)中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J].生物技術(shù),2006(1).

        [5]劉勇,張梅超,韋有恒,馬維駿GAL4/UAS系統(tǒng)在果蠅Tis11基因RNA干擾中的應(yīng)用[J].生命科學(xué)研究,2012(3).

        [6]李莉,楊洋,薛磊.Pax基因家族在果蠅發(fā)育過程中的調(diào)控作用[J].遺傳,2010(2).

        [7]吳越.利用GAL4/UAS系統(tǒng)篩選人類功能基因及Ras在果蠅眼中抑制細(xì)胞凋亡的機制[D],復(fù)旦大學(xué)博士論文集,2006.

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