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(黑龍江省能源環(huán)境研究院,哈爾濱 150027)

0 引 言

隨著人們生活水平的提高，對(duì)能源的消耗日益增加。據(jù)環(huán)保組織世界自然基金會(huì)(WWF)與可再生能源咨詢(xún)公司Ecofys的預(yù)測(cè)，在2050年，全球的能源消耗量將達(dá)到現(xiàn)今的兩倍。在化石能源消耗殆盡的情況下，人們紛紛把目光投向了生物能源。前段時(shí)間GCEP的報(bào)告稱(chēng)生物能源在總體新能源中占大概20%的比重，僅次于太陽(yáng)能。生物能源中的微藻柴油也正因此再次得到了人們的重視。

生物能源是解決能源問(wèn)題的關(guān)鍵。它是清潔能源的代表，不但有極好的可循環(huán)性，并且環(huán)境友好，綠色清潔，是21世紀(jì)初各國(guó)能源部門(mén)都十分關(guān)注的領(lǐng)域。生物能源的開(kāi)發(fā)、利用將有效的為社會(huì)發(fā)展提供動(dòng)力，并且?guī)?dòng)其他相關(guān)產(chǎn)業(yè)，如運(yùn)輸、發(fā)電、以及相關(guān)的制造業(yè)。生物能源的發(fā)展在即將來(lái)臨的能源革命中將會(huì)起到至關(guān)重要的作用。而微藻生物柴油就是生物能源領(lǐng)域中很有前景的一個(gè)重要方向[1-2]。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 菌 種

微藻(Chlorella Protothecoides), 從中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)淡水藻種庫(kù)購(gòu)得。

1.2 試劑與儀器設(shè)備

實(shí)驗(yàn)室中所用的培養(yǎng)皿為250～500 mL三角燒瓶，其中瓶塞經(jīng)過(guò)特殊處理可以用來(lái)進(jìn)行被動(dòng)氣體交換。

培養(yǎng)基為BG(Blue-Green Medium)培養(yǎng)基,見(jiàn)表1。

表1 BG培養(yǎng)基

儀器和設(shè)備見(jiàn)表2。

表2 儀器和設(shè)備列表

2 小球藻的實(shí)驗(yàn)方法

2.1 小球藻的富集培養(yǎng)

小球藻的富集工作是為了培養(yǎng)后續(xù)油脂累積實(shí)驗(yàn)所需要的藻源。按照實(shí)驗(yàn)需求分為光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)和異養(yǎng)無(wú)光照培養(yǎng)兩種形式。在光照培養(yǎng)箱中的光暗周期為15 h∶9 h,每天早晚需將燒瓶搖勻。暗培養(yǎng)箱則不需要任何的光照。為了防止各類(lèi)細(xì)菌污染，培養(yǎng)用工具器皿都要進(jìn)過(guò)高溫滅菌。定期用顯微鏡觀察藻種情況，確定生長(zhǎng)狀況以及是否存在污染。藻種的重新接種是為了保持藻種的新鮮程度，為油脂累積試驗(yàn)提供固定的年輕藻源。接種時(shí)通過(guò)測(cè)量吸光度和血球計(jì)數(shù)板確定接種密度，一般使用吸光度在1～2范圍內(nèi)的對(duì)數(shù)后期藻源接種。

2.2 油脂積累試驗(yàn)

在油脂累積實(shí)驗(yàn)中，不同的培養(yǎng)條件有不同的操作參數(shù)。實(shí)驗(yàn)中所用的培養(yǎng)基仍為BG培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的配置標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格遵循武漢水生所淡水藻庫(kù)所提供的配方。在變化碳源和氮源的試驗(yàn)中，培養(yǎng)基中所加入的配方比例經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的計(jì)算后改動(dòng)。由于考慮到土壤提取液中的碳氮含量，在設(shè)計(jì)氮源濃度，種類(lèi)，碳氮比，限氮等試驗(yàn)中不添加土壤提取液，以避免帶入不必要的干擾因素。

同時(shí)，通過(guò)加入1N HCl或1N NaOH 溶液的方式來(lái)調(diào)節(jié)pH值,使得試驗(yàn)中的培養(yǎng)液pH濃度在5～10之間。溫度范圍則設(shè)定在10～45 ℃之間。光照強(qiáng)度的設(shè)定范圍從0lux到5 000 lux。油脂累積實(shí)驗(yàn)中所用到的氮源有硫酸銨，硫酸鈉和酵母這三種，而碳源則有葡萄糖，乙酸鈉，混合碳源和模擬廢碳源這幾類(lèi)。

2.3 小球藻生物量及油脂測(cè)定方法

微藻的生物量測(cè)定與含油量的測(cè)定是試驗(yàn)的關(guān)鍵。試驗(yàn)中對(duì)各個(gè)細(xì)節(jié)的掌握和熟練的操作可以確保數(shù)據(jù)的精確。因此在試驗(yàn)進(jìn)行之前，本課題組所有參加試驗(yàn)的同學(xué)均經(jīng)過(guò)熟練的操作，經(jīng)過(guò)肯定后才可以參與處理核心試驗(yàn)的測(cè)量。

2.3.1 小球藻生物量的采收

試驗(yàn)中采用了離心法采收小球藻，將生長(zhǎng)到研究需要階段的藻液轉(zhuǎn)移到離心管中，放入離心機(jī)，在4 000 rpm的轉(zhuǎn)速下離心5 min，放棄上清液，將下層濃縮藻泥放入冰箱冷凍30 min后轉(zhuǎn)入冷凍干燥機(jī)中干燥24 h。取出后保存在4 ℃的冰箱中備用。

2.3.2 小球藻生物量的測(cè)定方法

生物量的測(cè)定主要通過(guò)使用分光光度計(jì)的濁度法和顯微鏡下血球計(jì)數(shù)板的方法來(lái)確定生物量，并且配合稱(chēng)重和吸光度值尋找最佳的生長(zhǎng)量擬合曲線。

2.3.3 細(xì)胞干重法

取4 mL 藻液置于已稱(chēng)重的5 mL離心管中，在5 000～7 000 rpm轉(zhuǎn)速下離心5 min，去上清液。并放于烘干箱中在65 ℃下烘干至恒重。同時(shí)測(cè)量三個(gè)平行樣，取平均值。

2.3.4 濁度法

使用紫外可見(jiàn)分光光度儀測(cè)量微藻溶液在波長(zhǎng)為540 nm下的吸光度(OD540)。用去離子水作為參比樣測(cè)量在540 nm時(shí)的吸光度。通過(guò)每天測(cè)得的吸光度繪制小球藻的生長(zhǎng)曲線。并對(duì)小球藻的生長(zhǎng)情況做出分析。

2.3.5 生長(zhǎng)曲線的確定

生長(zhǎng)曲線是將微藻溶液吸光度和干重相結(jié)合所得到的描述單一批次微藻生長(zhǎng)狀況的線。通過(guò)生長(zhǎng)曲線我們可從吸光度的大小直接聯(lián)系到藻液中含有藻量的干重，便于試驗(yàn)的進(jìn)展。

細(xì)胞干重的測(cè)量方法是生物量計(jì)算的最直接方法，但是由于過(guò)程中需要涉及到離心，洗滌和干燥幾個(gè)步驟，不然消耗很長(zhǎng)的時(shí)間動(dòng)起手來(lái)也比較繁瑣。因?yàn)榧?xì)胞濃度與干重之間存在著較好的正相關(guān)關(guān)系，所以我們可以建立一套標(biāo)準(zhǔn)曲線或者回歸方程，通過(guò)對(duì)吸光度的測(cè)量間接得到樣品中生物量的大小。這種計(jì)算方法也正是大多數(shù)的單細(xì)胞小球藻研究中所慣用的手段[3-5]。

在BG培養(yǎng)基、pH值自然狀態(tài)、光照強(qiáng)度2 000 lux、接種量1∶5、培養(yǎng)溫度25 ℃的條件下培養(yǎng)，得到如圖1所示的生長(zhǎng)曲線。

圖1 小球藻生長(zhǎng)曲線

2.4 小球藻油脂的提取

研究中所使用的優(yōu)質(zhì)提取技術(shù)是浸提法。溶劑浸提的方法是提取油脂的一種傳統(tǒng)方法，現(xiàn)實(shí)生活中比較常見(jiàn)。因?yàn)橹?lèi)不溶于水，卻易溶于有機(jī)溶劑，測(cè)定脂類(lèi)多時(shí)候采用沸點(diǎn)較低的有機(jī)溶劑萃取的方式。根據(jù)相似相容的規(guī)律，非極性的油脂要用非極性的溶劑，極性的糖脂要用極性的醇類(lèi)來(lái)提取。我們的研究中所采用的方法是正己烷和異丙醇向結(jié)合的提取方式，每4g干重的微藻需要300 mL的提取液，其中正己烷和異丙醇的體積比例為3∶2。為了做到?jīng)]有氣體揮發(fā)，提取用錐形瓶的瓶口需要用鋁箔紙密封。并且在800 rpm的轉(zhuǎn)速下反應(yīng)8 h。細(xì)胞殘留物在通過(guò)Whatman GF/C 濾紙時(shí)被去除。濾液被轉(zhuǎn)入分液漏斗并加入40 mL水作為誘導(dǎo)兩相穩(wěn)定的引導(dǎo)。當(dāng)混合溶劑分離出兩個(gè)不同的層面時(shí)，上層深綠色的正己烷層包含有被提取的油脂；下層淺綠色水醇混合層包含有非油脂類(lèi)藻細(xì)胞雜質(zhì)。正己烷層的液體將被移入到一個(gè)事先稱(chēng)量過(guò)的容器中，并在干燥箱內(nèi)以60 ℃的溫度蒸發(fā)。蒸發(fā)使得脂肪類(lèi)重量量化烘干。最終的油脂通過(guò)重新稱(chēng)重獲得。提取后的油脂可以溶解在20 mL的正己烷溶液中在4 ℃的條件下封存半個(gè)月備用。

3 結(jié)果與分析

環(huán)境因素是影響藻類(lèi)生長(zhǎng)和代謝的主要因素之一。在不同的環(huán)境條件影響下，一種藻的生長(zhǎng)狀態(tài)和內(nèi)部能量變化都產(chǎn)生微妙的變化[6-7]。在掌握了環(huán)境因素對(duì)藻類(lèi)培養(yǎng)的影響后，即可以做到在實(shí)驗(yàn)時(shí)排除不必要的影響因子，使得實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵因素可以更加準(zhǔn)確，穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)中各變量是在其他相關(guān)量確定的基礎(chǔ)上進(jìn)行調(diào)整。以此來(lái)尋找到一個(gè)最佳的試驗(yàn)條件。同時(shí)，為了提高數(shù)據(jù)可靠性與準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)中的各項(xiàng)數(shù)據(jù)均為與平行樣的平均值。

3.1 培養(yǎng)溫度

單細(xì)胞藻類(lèi)在光合作用的過(guò)程中，需要一定的溫度范圍。溫度的變化例如升溫或者降溫的時(shí)候會(huì)對(duì)光合作用有一定的促進(jìn)或者抑制作用。有研究指出光合作用和呼吸作用的強(qiáng)度都會(huì)被溫度所影響，而這兩大支柱卻都是和微藻的生長(zhǎng)代謝有著緊密的關(guān)系。并且微藻屬于生態(tài)熱型微生物，它們必須從環(huán)境中得到熱源，溫度的大幅度變化會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)速率，新陳代謝效率和細(xì)胞內(nèi)的生化反應(yīng)速度[8]。因此培養(yǎng)時(shí)的溫度是影響單細(xì)胞微藻生長(zhǎng)的重要因素之一。微藻可以適應(yīng)的溫度往往在15～40 ℃之間。而且不同種類(lèi)的微藻所適應(yīng)的范圍也有所不同。單細(xì)胞的綠藻小球藻最適合的溫度上限在36 ℃左右而最合適的溫度應(yīng)在25～32 ℃之間。

所以這組實(shí)驗(yàn)的目的是在確定的無(wú)光培養(yǎng)狀態(tài)下，在其他因素穩(wěn)定的條件里，尋找到最節(jié)能而且效率最高的的培養(yǎng)溫度。實(shí)驗(yàn)中的溫度變化分為20、 25、30、32 ℃幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。光照為0lux；初始pH為6.8；搖速為160 rpm；通氣量為50 mL/d；培養(yǎng)基為BG培養(yǎng)基；葡萄糖碳源濃度為1 g/L，培養(yǎng)72 h。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同培養(yǎng)溫度

通過(guò)上表3所示，可以看出當(dāng)培養(yǎng)溫度在27.5和30 ℃時(shí)，吸光度(540 nm)相同且最大，也就是藻體濃度最大，所以微藻最適生長(zhǎng)溫度為27.5 ℃。

3.2 初始pH

培養(yǎng)基中的初始pH值會(huì)影響微藻生長(zhǎng)及新陳代謝等很多生化反應(yīng)的一個(gè)重要因素，pH會(huì)干涉光合作用里二氧化碳的使用性，同時(shí)在呼吸作用中將會(huì)影響微藻利用有機(jī)碳源效率。并且因?yàn)閜H可以影響細(xì)胞壁的滲透性能，從而會(huì)使得細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)液中的營(yíng)養(yǎng)離子的吸收和利用受到一定的影響。同時(shí)新陳代謝的中間產(chǎn)物的重復(fù)利用和藻內(nèi)毒性也會(huì)有一定影響。與溫度和光照相同，最適合藻類(lèi)生長(zhǎng)的pH在不同藻種間各有不同。有研究指出[9]，最適合微藻生長(zhǎng)的pH在5到8之間，pH7是最合適的。還有研究指出[10]，因?yàn)樯L(zhǎng)過(guò)程中微藻會(huì)因?yàn)槎趸嫉奈帐筽H升高，所以最佳的初始pH應(yīng)該為6左右。所以我們的研究將在pH5到10這個(gè)范圍中考察C. protothecoides 3的生長(zhǎng)情況和油脂累積效果。

所以本實(shí)驗(yàn)的目的是尋找到一個(gè)最適合C.protothecoides 3生長(zhǎng)和油脂累積的pH值。實(shí)驗(yàn)中的pH變化分為5.5、6.5、7.5、8.5幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)。光照為0lux；溫度為25 ℃；搖速為160 rpm；通氣量為50 mL/d；培養(yǎng)基為BG培養(yǎng)基；葡萄糖碳源濃度為1 g/L，接種量1∶5，培養(yǎng)72 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 微藻不同初始pH值條件下的生長(zhǎng)情況

通過(guò)上表4所示，可以看出當(dāng)初始pH值在5.5時(shí)，吸光度(540 nm)最大，也就是藻體濃度最大，所以微藻最適生長(zhǎng)的初始pH值為5.5。

3.3 接種量

初始接種影響藻種的繁殖速度，在BG培養(yǎng)基、初始pH自然狀態(tài)、光照強(qiáng)度0lux、培養(yǎng)溫度25 ℃的條件下培養(yǎng)時(shí)間72 h。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 微藻在不同接種量的情況下的生長(zhǎng)情況

通過(guò)上表所示，可以看出當(dāng)接種量在1∶5時(shí)，吸光度(540 nm)最大，也就是藻體濃度最大，所以微藻最適生長(zhǎng)的接種量為1∶5。

3.4 有機(jī)碳源

有機(jī)碳源是一切生物生長(zhǎng)的必須能源，所以有機(jī)碳源的濃度對(duì)藻種生長(zhǎng)速率有重要的影響，在BG培養(yǎng)基、pH值自然狀態(tài)、光照強(qiáng)度0lux、接種量1∶5、培養(yǎng)溫度25 ℃的條件下培養(yǎng)時(shí)間72 h。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 微藻在不同培養(yǎng)基條件下的生長(zhǎng)情況

通過(guò)表6所示，可以看出當(dāng)培養(yǎng)基為BG+2 g/LC6H12O6時(shí)，吸光度(540 nm)最大，也就是藻體濃度最大，所以微藻最適生長(zhǎng)的培養(yǎng)基為BG+2 g/LC6H12O6。

4 總 結(jié)

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究表明合理的碳氮比對(duì)微藻的生長(zhǎng)有很大的影響。在其他條件不變的情況下，可以發(fā)現(xiàn)隨著有機(jī)碳的增加微藻的生物量也在增加，但當(dāng)?shù)竭_(dá)一定生物量后，即使有機(jī)碳的量增加，生物量也不再有變化了。同時(shí)也看出在沒(méi)有有機(jī)碳存在的條件下培養(yǎng)，微藻生物量明顯比有機(jī)碳存在的條件下培養(yǎng)的生物量小。實(shí)驗(yàn)研究表明微藻最適生長(zhǎng)條件為接種量1∶5、初始pH值5.5、培養(yǎng)溫度27.5 ℃和BG+2 g/LC6H12O6培養(yǎng)基。

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