謝仁卓瑪, 張立成

(1.青海省海南州畜牧獸醫(yī)工作站,813000；2.青海省動(dòng)物檢疫站，810007)

豬氣喘病，又稱(chēng)豬支原體肺炎，豬地方性肺炎，是由豬肺炎支原體（Mycolasma hyopneumoniaw，Mhp）引起的一種豬慢性、接觸性呼吸道傳染病，具有氣喘和咳嗽、患病豬只生長(zhǎng)緩慢和發(fā)育不良等特點(diǎn)。Mhp經(jīng)常與圓環(huán)病毒等其他肺部病原體混合感染，易造成更大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究從發(fā)病豬病料中分離、鑒定獲得了1株豬肺炎支原體，為該病病原研究提供了基礎(chǔ)。從豬喘氣病病例中分離得到1株病原菌，對(duì)病原菌進(jìn)行分離培養(yǎng)、姬姆薩染色、致病性及攻毒再分離等鑒定，確定分離到的病原菌為豬肺炎支原體，并命名為Bz1株。

1 材料與方法

1.1病料的采集和處理 病料采集于某豬場(chǎng)疑似患有豬喘氣病的豬肺部，用研磨法對(duì)肺部組織進(jìn)行處理。取1 g病變與健康肺臟交界處的組織剪碎，按1:1比例加入生理鹽水，用研缽充分研磨，并用0.45μm的濾膜過(guò)濾，收集濾液。操作應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行。

1.2培養(yǎng)用培養(yǎng)基 采用的是KM2豬肺炎霉形體培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基配方：乳清蛋白水解物10.0 g，新鮮酵母浸出物20.0 g，Eagles氏液1000.0 mL，Dulbecco磷酸緩沖液600.0 mL；健康豬血清400.0 mL，0.4%酚紅3.5 mL，1%的醋酸鉈25.0 mL，青霉素40萬(wàn)IU，pH為7.4～7.6。加入1%瓊脂粉即可制成固體培養(yǎng)基。

1.3菌株分離 將1.1收集的濾液，按1:5的比例加入KM2培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)3 d～7 d，觀察其培養(yǎng)基顏色變化和透明度情況。當(dāng)培養(yǎng)基顏色呈現(xiàn)透亮的黃色時(shí)，劃線(xiàn)接種固體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)7 d～10 d，觀察菌落生長(zhǎng)情況。

1.4染色并鏡檢 本研究用姬姆薩染色法進(jìn)行染色。姬姆薩染料0.6 g溶解于50 mL甘油中，55℃水浴2 h，再加50 mL靜置1d以上，濾膜過(guò)濾后即得姬姆薩染液原液，染色前每60 mL蒸餾水中加一滴原液，制成姬姆薩染色液。培養(yǎng)物制成涂片，自然干燥，用甲醇固定3min（或用火焰固定），再用磷酸鹽緩沖液（pH7.2）稀釋20倍的姬姆薩染液染色3h水洗，丙酮浸染，然后鏡檢。

1.5菌株的致病性試驗(yàn) 將經(jīng)培養(yǎng)試驗(yàn)和姬姆薩染色鑒定呈陽(yáng)性的豬肺炎支原體新鮮培養(yǎng)物5 mL直接氣管注射3頭健康豬，同時(shí)設(shè)2頭健康豬作為陰性對(duì)照。攻毒后按常規(guī)飼養(yǎng)，飼料中無(wú)抗生素。攻毒后28 d內(nèi)逐日觀察，攻毒后28 d剖檢試驗(yàn)豬。

1.6攻毒豬病變肺中支原體的再分離 用1.3的方法從攻毒豬病變肺中進(jìn)行豬肺炎支原體的再分離，并用1.4和1.5的方法進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果

2.1菌體分離及培養(yǎng)結(jié)果 分離菌株培養(yǎng)3d后，培養(yǎng)液開(kāi)始呈現(xiàn)黃色并保持透亮，肉眼觀察可見(jiàn)細(xì)小的懸浮物出現(xiàn)。固體培養(yǎng)基上可觀察到圓形凸起、表面粗糙、邊緣整齊的菌落。

2.2染色及鏡檢結(jié)果 取培養(yǎng)物涂片，經(jīng)姬姆薩染色染色，可觀察到球狀、環(huán)狀、橢圓形或兩極型、單個(gè)或聚集的菌體，無(wú)雜菌污染。

2.3致病性試驗(yàn)攻毒豬出現(xiàn)咳嗽、喘氣等臨床癥狀，攻毒28 d后剖檢攻毒豬，肺部出現(xiàn)典型豬支原體肺炎病變。

2.4攻毒豬病變肺中支原體的再分離 將攻毒豬肺按1.3的方法再分離豬肺炎支原體，傳代培養(yǎng)后顯示pH值下降，涂片染色鏡檢發(fā)現(xiàn)具有支原體特征的菌體。

3 討論

豬喘氣病病原菌豬肺炎支原體的分離鑒定工作非常困難，由于其營(yíng)養(yǎng)要求高且生長(zhǎng)緩慢，往往被豬鼻支原體、絮狀支原體、滑液支原體掩蓋。本研究采用KM2培養(yǎng)基進(jìn)行分離和培育，該培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分豐富、檢出率高、方便實(shí)用。本研究采用研磨法對(duì)病料進(jìn)行處理，可以使豬肺炎支原體更多的暴露在培養(yǎng)基中，與剪碎法、灌洗法、勻漿法相比，雖然研磨法對(duì)豬肺炎支原體生長(zhǎng)影響比較大，但是檢出率高，因此選用研磨法處理豬肺炎支原體病料是首選方法。本研究分離到的該病原菌，經(jīng)培養(yǎng)特征、形態(tài)觀察、鏡檢、致病性、攻毒再分離等試驗(yàn)，確定分離株為豬肺炎支原體，命名為豬肺炎支原體Bz1株。本研究也充分驗(yàn)證了科赫法則的理論，即一種病原微生物必然存在于患病動(dòng)物體內(nèi)；此病原微生物可從患病動(dòng)物分離得到純培養(yǎng)物；將分離出的純培養(yǎng)物人工接種敏感動(dòng)物時(shí)，必定出現(xiàn)該疾病所特有的癥狀；從人工接種的動(dòng)物可以再次分離出性狀與原有病原微生物相同的純培養(yǎng)物。豬肺炎支原體是豬呼吸道疾病綜合癥的一種原發(fā)性病原，能引起豬地方流行性肺炎。分離獲得該病的具有致病力毒株將對(duì)該病的發(fā)病模型建立提供基本材料。

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