吳柳松，馮永懷，錢民章

(1.遵義醫(yī)學院 生物化學教研室，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院 血液內(nèi)科，貴州 遵義 563099)

同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)是體內(nèi)蛋氨酸轉(zhuǎn)甲基過程中重要的中間產(chǎn)物，由S-腺苷蛋氨酸提供甲基后進一步脫去腺苷生成。研究發(fā)現(xiàn)，Hcy能促進脂質(zhì)沉積于動脈壁，引起內(nèi)皮細胞損傷，促進血栓調(diào)節(jié)因子的表達，增加血小板的粘附性，促進血栓形成等。大量臨床研究顯示，高同型半胱氨酸血癥者患動脈粥樣硬化(arteriosclerosis,As)等血管性疾病的危險性明顯增加，現(xiàn)已明確高Hcy血癥是As及心腦血管疾病發(fā)生的一個獨立危險因素[1]，研究Hcy與心血管病的關(guān)系受到基礎和臨床醫(yī)學的重視。

MCPIP(Monocyte chemoattractant protein-1 induced protein，MCPIP)是2006年報道的一種新的鋅指型轉(zhuǎn)錄因子，并具有核糖核酸酶活性[2]。研究證實，該轉(zhuǎn)錄因子參與促細胞凋亡、細胞自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、炎癥抑制、細胞分化、血管生成等多種生理病理過程[3]。單核細胞趨化蛋白-1(Monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)是最初發(fā)現(xiàn)能誘導MCPIP表達的因子，以后相繼發(fā)現(xiàn)TNF-a、IL-1β及LPS等均可上調(diào)人血管內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)中MCPIP表達[4]。在小鼠及人As斑塊組織發(fā)現(xiàn)MCPIP表達顯著增加[8]，表明MCPIP與As密切相關(guān)。

鑒于Hcy是致As的重要因素之一，而MCPIP又與As有著密切關(guān)系，Hcy是否能誘導該轉(zhuǎn)錄因子表達，值得關(guān)注。

我們以體外培養(yǎng)的HUVEC為研究對象，觀察了Hcy對血管內(nèi)皮細胞中MCPIP表達的影響，以進一步完善對MCPIP誘導因素的認識，并從新的角度認識Hcy致As的機理。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料 HUVECs細胞株(中南大學湘雅細胞庫)，Hcy(Sigma公司)，1 640培養(yǎng)基(Hyclone,USA)，胎牛血清(Hyclone,USA)，Trizol(Invitrogen,USA),MCPIP一抗(兔抗人)(Abgent公司)，β-actin一抗(兔抗人)(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，PCR引物(上海生工生物工程公司)，RT-PCR試劑盒(TakaRa公司)。

1.2 主要儀器 超凈工作臺，蘇州凈化設備廠；細胞培養(yǎng)箱，BeckMan公司；倒置顯微鏡，日本Olympus公司；核酸蛋白分析儀，Thermo公司；PCR儀，BIO-RAD公司；酶標儀，BIO-RAD公司；熒光顯微鏡IX71，日本Olympus公司；凝膠成像系統(tǒng)，BIO-RAD公司。

1.3 HUVECs培養(yǎng)及鑒定 HUVECs用含10%FBS、100 U/mL青霉素、鏈霉素的1 640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長融合至鋪滿細胞瓶底進行傳代，取生長狀態(tài)良好并處于對數(shù)生長期細胞用于實驗。采用人VIII因子免疫熒光法鑒定人臍靜脈內(nèi)皮細胞株。

1.4 Real-time PCR檢測MCPIP mRNA 轉(zhuǎn)錄 以1×106個細胞/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，同步化24 h。分別用10 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、500 μmol/L Hcy與HUVECs孵24 h。用100 μmol/L Hcy與HUVECs分別孵育1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h。按Trizol試劑盒操作要求提取總RNA，按RT-PCR試劑盒操作進行反轉(zhuǎn)錄。擴增的cDNA加入到20 μL的反應體系中。

MCPIP及內(nèi)參引物序列如下：

MCPIP F:5′-GTGGTCATCGATGGGAGCAA-3′，R:5′-CCTCCAGGATGGCACAAACA-3′;GADPH F:5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′,R:5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。Real-time PCR反應條件：95 ℃,3 min；39cycles：95 ℃，5 s,59.5 ℃,30 s。

1.5 Western blot檢測MCPIP蛋白表達 取生長狀態(tài)良好的細胞，用含1%FBS的1 640培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h使細胞同步化，分別用10、50、100、200、500 μmol/LHcy與HUVECs孵育24 h。用100 μmol/L Hcy與HUVECs分別孵育1、2、4、8、12、24 h。細胞裂解液裂解細胞，離心后上清用BCA法測定蛋白濃度，蛋白定量60 μg，煮沸5 min,上樣于10%SDS-PAGE膠，電泳1.5 h，全濕式電轉(zhuǎn)將分離膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。室溫下用含5%脫脂奶粉封閉1 h。加入一抗(兔抗人MCPIP多克隆抗體，1∶1000；兔抗人β-actin 1∶1000)及二抗(羊抗兔，1∶1000)，化學發(fā)光檢測目的條帶，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察分析并拍照。用目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度值之比計算MCPIP表達量。

2 結(jié)果

2.1 人臍靜脈內(nèi)皮細胞的培養(yǎng)與鑒定 在倒置顯微鏡下觀察，貼壁的HUVECs為單層扁平生長，略長，呈多角形，在內(nèi)皮細胞中央，即細胞核所在部位，略為隆起，呈典型的“鋪路石”或“鵝卵石”樣外觀形態(tài)特征。細胞胞漿豐富，可見清晰胞核，為圓形或橢圓形，細胞間細胞連接清晰可見(見圖1)。人VIII因子相關(guān)抗原檢測結(jié)果顯示，細胞漿內(nèi)可見棕色顆粒，核周密集，即為陽性反應，證實培養(yǎng)的細胞為人臍靜脈內(nèi)皮細胞(見圖2)。

圖1 HUVECs在倒置顯微鏡下的形態(tài)(A×200；B×400)

圖2 HUVECs通過Ⅷ因子免疫熒光染色鑒定(A×200；B×400)

2.2 Real-time PCR檢測不同濃度Hcy對HUVECs中MCPIP mRNA表達影響 分別用10、50、100、200、500 μmol/L Hcy作用HUVECs24 h后，用Real-time PCR檢測細胞中MCPIP mRNA的表達，結(jié)果顯示，MCPIP mRNA的表達量在Hcy 10～100 μmol/L濃度范圍內(nèi)隨濃度的增加而增加；當Hcy濃度為100 μmol/L時達到峰值，之后，隨Hcy濃度的進一步增加而減少(見圖3)。除10 μmol/L組外，其他各劑量組與對照組相比，均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

注：與control組比較，*P<0.05,**P<0.01。 圖3 不同劑量Hcy作用HUVEC24 h后MCPIP mRNA表達

2.3 Western blot檢測不同濃度Hcy對HUVECs中MCPIP蛋白表達影響 分別用10、50、100、200、500 μmol/L Hcy作用HUVECs24 h后，Western blot檢測各組細胞MCPIP蛋白表達變化，Image J軟件分析條帶灰度值。與Real-time PCR結(jié)果相似：MCPIP蛋白的表達量起初隨Hcy濃度的增加而增加，當Hcy濃度為100 μmol/L Hcy時達到峰值，之后，隨Hcy濃度的進一步增加減少。除10 μmol/L組外，其他各劑量組與對照組相比，均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(見圖4A、B)。

注：與control組比較，*P<0.05,**P<0.01。 圖4 不同劑量Hcy作用HUVEC24 h后MCPIP蛋白表達

2.4 Real-time PCR檢測相同濃度Hcy在不同時間點對HUVECs中MCPIP mRNA表達影響 用100 μmol/L Hcy分別作用HUVECs1、2、4、8、12、24 h后，提取細胞總RNA，Real-time PCR檢測各時間點MCPIP mRNA表達水平。實驗結(jié)果顯示：Hcy作用細胞2 h以后，與空白對照組相比，HUVECs中MCPIP mRNA表達有明顯差異(P<0.05)；隨著時間延長，MCPIP mRNA表達水平逐漸升高，在Hcy作用HUVECs24 h后表達最高(見圖5)。

注：與control組比較，*P<0.05,**P<0.01。 圖5 相同濃度Hcy作用HUVEC不同時間MCPIP mRNA表達

2.5 Western blot檢測相同濃度Hcy在不同時間點對HUVECs中MCPIP蛋白表達影響 用100 μmol/L Hcy作用HUVECs1、2、4、8、12、24 h后，Western blot檢測HUVECs中MCPIP蛋白的表達水平，結(jié)果顯示：與空白對照組相比，Hcy作用細胞2 h后的各時間點HUVECs中MCPIP表達有統(tǒng)計學意義(P<0.05,)；隨著時間延長，MCPIP表達水平逐漸升高，在24 h時間點表達最高(見圖6A、B)。

注：與control組比較，*P<0.05,**P<0.01。 圖6 相同濃度Hcy作用HUVEC不同時間MCPIP蛋白表達

3 討論

Hcy是一種含巰基的氨基酸，主要來源于飲食攝取的蛋氨酸，正常人體內(nèi)Hcy的濃度為5～15 μmol/L。本實驗中生理濃度(10 μmol/L)的Hcy處理HUVECs后，與空白對照組比較，細胞內(nèi)MCPIP表達量略有增加，但不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。提示在正常生理狀況下，Hcy作為體內(nèi)蛋氨酸循環(huán)的正常代謝產(chǎn)物，有可能會誘導HUVECs中MCPIP表達有所增加，但這種上調(diào)作用在正常范圍之內(nèi)。

除生理濃度外，實驗設置的其他濃度的Hcy均能顯著上調(diào)HUVECs中MCPIP mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白合成量。在10～100 μmol/L濃度范圍內(nèi)，MCPIP表達量隨著Hcy濃度的增加而逐漸增加。當Hcy濃度達100 μmol/L后，隨Hcy濃度的增加MCPIP表達量呈現(xiàn)減少趨勢，但與對照組相比差異仍具有統(tǒng)計學意義。此結(jié)果表明：Hcy可明顯誘導HVEC中MCPIP表達，但表達量與Hcy的濃度不呈單純的劑量效應。

用100 μmol/L Hcy分別作用HUVECs1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h后發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，在2 h以內(nèi)，Hcy干預組較空白對照組MCPIP表達略有增加，但不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，這與Kalattukudy P.E研究組2008年用LPS處理髓系巨噬細胞時發(fā)現(xiàn)前兩小時內(nèi)該細胞中MCPIP mRNA呈較低水平表達結(jié)果相似[4]。在Hcy作用細胞2 h以后，隨著時間延長，MCPIP表達水平逐漸升高，24 h后表達量最高。表明Hcy對HUVECs的作用時間與MCPIP表達量呈時間依賴關(guān)系。

此外，Hcy作用HUVECs后，細胞內(nèi)MCPIP表達量與Hcy作用劑量和作用時間關(guān)系的研究均表明：Real-time PCR及Western blot的結(jié)果一致，說明Hcy誘導HUVECs中MCPIP轉(zhuǎn)錄增加后，mRNA摸板在轉(zhuǎn)錄后的加工過程中沒有發(fā)生異常修飾或降解，致使翻譯出的蛋白量與mRNA轉(zhuǎn)錄量的變化一致。

Hcy通過什么機制和信號途徑上調(diào)HUVECs中MCPIP的表達，目前尚不清楚。倪嵐[5]和周繼紅[6]等相繼研究發(fā)現(xiàn)，用Hcy作用HUVECs后，可通過增強IκB-α的磷酸化，抑制血管內(nèi)皮細胞IκB-α的活性，從而使細胞內(nèi)核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)活化。由此可推測，Hcy有可能是通過激活NF-κB信號通路，使炎性分子表達增加，炎性分子再誘導了MCPIP表達增強。

SkaliniakL等人報道，在NF-κB和MCPIP之間存在一個負反饋環(huán)：NF-κB信號通路調(diào)控的一些炎性細胞因子如IL-1β能誘導巨噬細胞中MCPIP表達，而當細胞中MCPIP表達增加到一定程度后，反過來抑制NF-κB的活化，抑制細胞炎性分子產(chǎn)生，從而抑制MCPIP表達[7-8]。如果Hcy是通過激活NF-κB信號通路誘導MCPIP表達，本實驗中觀察到Hcy濃度達到100 μmol/L以后，MCPIP表達量隨Hcy劑量的增加而降低的原因有可能與此有關(guān)，但尚需實驗證實。

本研究結(jié)果表明，除MCP-1和已報道的幾種炎性因子外，Hcy也是誘導MCPIP表達的因素，這一發(fā)現(xiàn)豐富了對MCPIP誘導因子的認識，也提示Hcy致As是機理可能與誘導該轉(zhuǎn)錄因子表達有關(guān)。但這三者之間的關(guān)系及Hcy通過什么機制和信號途徑上調(diào)HUVECs中MCPIP的表達，需要深入研究。

[參考文獻]

[1] Graham I M,Daly L E,Refsum H M,et al.Plasma homocysteine as a risk factor for vascular disease[J].The European Concerted Action Project，1997，277(22):1775-1778.

[2] Zhou L M,Azfer A,Niu J L，et al.Monocyte Chemoattractant Protein-1 Induces a Novel Transcription Factor That Causes Cardiac Myocyte Apoptosis and Ventricular Dysfunction[J].Circ Res,2006，98(9):1177-1185.

[3] Kolattukudy P E,Niu J.Inflammation,endoplasmic reticulum stress,autophagy,and the monocyte chemoattractant protein-1/CCR2 pathway[J].Circ Res,2012，110(1):174-189.

[4] Liang J,Wang J,Azfer A，et al.A novel CCCH-zinc finger protein family regulates proinflammatory activation of macrophages[J].J Biol Chem，2008，283(10):6337-6346.

[5] 倪嵐，沈關(guān)心，王國平.同型半胱氨酸對血管內(nèi)皮細胞NF-κB的激活及其機制的探討[J].華中科技大學學報：醫(yī)學版，2007，36(1):13-16.

[6] 周繼紅，章蕘．同型半胱氨酸對血管內(nèi)皮細胞凋亡和核因子-κB活化的影響[J].蚌埠醫(yī)學院學報，2011，36(2):117-120.

[7] Qin Y F,Liang J,She Z G，et al.MCP-induced protein 1suppresses TNFa-induced VCAM-1expression in human endothelial cells[J].Febs J，2010，584(14):3065-3072.

[8] Liang J,Saad Y,Lei T，et al.MCP-induced protein1 deubiquitinates TRAF proteins and negatively regulates JNK and NF-kappaB signaling[J].J Exp Med，2010，207(13):2959-2973.