白國(guó)輝，劉建國(guó)，田 源，管曉燕，顧 瑜，白朋元，周皓琳，范 繁

( 1.遵義醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究中心， 貴州 遵義 563099；2.貴州省高等學(xué)校 口腔疾病研究特色重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義 563099)

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是將某些抗病、高產(chǎn)、提高品質(zhì)等已知功能性狀的基因，通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)手段移植到目標(biāo)生物體中，使受體生物在原有遺傳特性基礎(chǔ)上增加新的功能特性，獲得新的品種和產(chǎn)品，使農(nóng)作物的生產(chǎn)向人類需要的目標(biāo)轉(zhuǎn)變[1]。但是多個(gè)外源目的基因之間以及目的基因與植物基因組基因之間都有可能發(fā)生潛在的相互作用，引起某些基因的沉默或激活，從而影響基因表達(dá)的結(jié)果，這些問(wèn)題已經(jīng)被社會(huì)和政府高度重視。

本課題組前期研究中選擇番茄做為生物反應(yīng)器，研制了攜帶變異鏈球菌表面蛋白PAc粘附相關(guān)肽段基因pacA與霍亂毒素B亞單位(CTB)基因ctxB的轉(zhuǎn)基因番茄防齲疫苗，希望尋找到一條價(jià)廉物美，預(yù)防接種的方法易于被人群接受而且對(duì)機(jī)體和環(huán)境無(wú)損害的防齲方式[2]。動(dòng)物免疫實(shí)驗(yàn)已證實(shí)其具有良好的免疫原性，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答反應(yīng)[3]，初步證實(shí)所用的轉(zhuǎn)基因番茄防齲疫苗是安全無(wú)毒的[4-5]，并進(jìn)行了外源基因漂移檢測(cè)、外源目的基因拷貝數(shù)檢測(cè)[6-7]。本研究探討本課題組培育轉(zhuǎn)基因番茄植株與非轉(zhuǎn)基因番茄植株農(nóng)藝性狀的差異，為最終實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物嵌合體防齲疫苗的商品化生產(chǎn)打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 含目的基因pacA-ctxB片段的轉(zhuǎn)基因番茄種子(本課題組前期培育)，非轉(zhuǎn)基因番茄種子(山西豪豐種苗有限公司)。

1.2 田間種植設(shè)計(jì) 田間試驗(yàn)在貴州省遵義市河溪村紅田組進(jìn)行，種植轉(zhuǎn)基因番茄和非轉(zhuǎn)基因番茄2個(gè)品系。實(shí)驗(yàn)地主要風(fēng)向是從北向南，在生殖隔離狀態(tài)下，轉(zhuǎn)基因番茄種植8行-5列，共40株，沿南北方向排列，非轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M番茄40株。植株間距均為0.7 m。

1.3 研究方法 試驗(yàn)于2010年5月進(jìn)行，5月10日育苗，30 d后定植。定植前及定植后每周記錄番茄生長(zhǎng)的一般狀況，記錄植株株高、莖粗、最大葉寬情況，調(diào)查持續(xù)到番茄的果實(shí)成熟期。每次株高、莖粗、最大葉寬觀測(cè)3次取平均值。株高和最大葉寬用卷尺測(cè)定，番茄植株莖粗用游標(biāo)卡尺測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 一般生長(zhǎng)情況 轉(zhuǎn)基因番茄有3株、非轉(zhuǎn)基因番茄有2株出現(xiàn)葉片發(fā)黃、蟲食孔、生長(zhǎng)緩慢、最終死亡，經(jīng)分析是出現(xiàn)蟲害現(xiàn)象，與品種及外源基因無(wú)關(guān)。其他轉(zhuǎn)基因番茄和非轉(zhuǎn)基因番茄生長(zhǎng)狀態(tài)均良好，植株粗壯，葉片深綠。

2.2 株高、莖粗、最大葉寬情況 定植前及定植后不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行比較，轉(zhuǎn)基因番茄與非轉(zhuǎn)基因番茄植株的株高在30 d、37 d差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，轉(zhuǎn)基因番茄植株生長(zhǎng)較慢，之后各時(shí)間點(diǎn)比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；轉(zhuǎn)基因番茄與非轉(zhuǎn)基因番茄植株的莖粗在各時(shí)間點(diǎn)比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，轉(zhuǎn)基因番茄莖粗較細(xì)；轉(zhuǎn)基因番茄與非轉(zhuǎn)基因番茄植株的最大葉寬在各時(shí)間點(diǎn)比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，轉(zhuǎn)基因番茄最大葉寬較窄(見(jiàn)表1)。

時(shí)間(d)株高(cm)轉(zhuǎn)基因組非轉(zhuǎn)基因組莖粗(cm)轉(zhuǎn)基因組非轉(zhuǎn)基因組最大葉寬(cm)轉(zhuǎn)基因組非轉(zhuǎn)基因組306.74±1.34*8.48±1.470.20±0.06*0.23±0.041.75±0.25*1.98±0.503713.08±2.36*14.09±1.950.51±0.07*0.61±0.092.58±0.38*3.12±0.414421.68±3.7822.66±3.040.69±0.09*0.84±0.123.74±0.60*4.24±0.715136.75±3.8537.28±3.730.80±0.18*1.03±0.184.55±0.74*5.14±0.655848.59±6.3250.86±4.980.92±0.21*1.24±0.235.31±0.83*6.21±0.896556.78±8.3859.50±6.281.07±0.12*1.36±0.186.30±1.21*7.30±1.297268.10±11.6569.16±6.991.27±0.16*1.61±0.186.84±0.91*7.60±1.077982.34±17.8887.05±14.481.32±0.22*1.70±0.167.23±0.86*7.77±0.838692.46±18.1598.00±10.791.37±0.24*1.70±0.117.42±0.62*7.93±0.799398.86±19.63105.32±10.671.40±0.20*1.74±0.097.45±1.24*8.44±0.72100101.64±23.75109.47±11.371.41±0.17*1.74±0.097.73±0.71*8.48±0.66

注：*表示與非轉(zhuǎn)基因組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

轉(zhuǎn)基因植物研究的目的是希望得到有價(jià)值的中間材料，進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)或用于農(nóng)作物品種的培育，該目的的實(shí)現(xiàn)不僅與轉(zhuǎn)化技術(shù)和不同的外源基因有關(guān)，還與轉(zhuǎn)基因植物培育成功后的生物特性密切相關(guān)[8]。有部分研究結(jié)果顯示，利用分子生物學(xué)技術(shù)得到的轉(zhuǎn)基因植物在農(nóng)藝性狀方面會(huì)有一些改變[9-10]，對(duì)于導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植物農(nóng)藝性狀變化的原因可能有幾點(diǎn)[11]：①外源基因的插入；②在轉(zhuǎn)化過(guò)程中的組織培養(yǎng)階段產(chǎn)生的；③轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)影響轉(zhuǎn)基因植物農(nóng)藝性狀變化的一個(gè)重要因素是轉(zhuǎn)基因方法的選擇[12]?，F(xiàn)常用的將外源基因整合到植物基因組中方法有農(nóng)桿菌介導(dǎo)法、基因槍法、電擊法和原生質(zhì)體聚乙烯乙二醇介導(dǎo)DNA法。目前還不能實(shí)現(xiàn)將外源基因整合在特定的基因座或?qū)?dǎo)入基因的拷貝數(shù)進(jìn)行控制，所以外源目的基因是以隨意的方式插入到植物基因組中。研究證實(shí)外源目的基因插入植物基因組的位置不同而表型和插入拷貝數(shù)的不同均會(huì)引起轉(zhuǎn)基因植株后代農(nóng)藝性狀的變化。除此之外，轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)變化包括轉(zhuǎn)基因斷裂、倒置、缺失以及其他復(fù)雜的重排，都會(huì)對(duì)轉(zhuǎn)基因植物的表型和遺傳產(chǎn)生一定的影響，這些不可控制性的因素存在讓科研人員很難區(qū)分轉(zhuǎn)基因本身的效應(yīng)與相伴發(fā)生的不可控制因子的效應(yīng)[13-14]。

在本研究中轉(zhuǎn)基因番茄植株與非轉(zhuǎn)基因番茄植株生長(zhǎng)情況良好，轉(zhuǎn)基因番茄植株的株高、莖粗和最大葉寬經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析與對(duì)照組植株比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但轉(zhuǎn)基因植物農(nóng)藝性狀的變化方向和程度從現(xiàn)階段的研究來(lái)看并不確定，在同一物種轉(zhuǎn)入不同的外源基因甚至同一物種轉(zhuǎn)入相同的外源基因后農(nóng)藝性狀的變化也不相同。本實(shí)驗(yàn)只針對(duì)轉(zhuǎn)基因番茄農(nóng)藝性狀的個(gè)別指標(biāo)進(jìn)行初步的探索，想成功的通過(guò)分子生物學(xué)手段獲得新的物種資源或者進(jìn)一步培育出新的品種是一項(xiàng)艱難的工作，必須進(jìn)行更全面、深入的研究。

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